人結(jié)腸癌羥基喜樹堿多藥耐藥的分子機制研究.pdf

1、目的：為結(jié)腸癌多藥耐藥研究建立實驗?zāi)Ｐ?，進一步研究消化道腫瘤的多藥耐藥機制。 方法：應(yīng)用藥物濃度遞增法建立人結(jié)腸癌羥基喜樹堿耐藥細胞株Swll16／HCPT：細胞計數(shù)法測定細胞生長曲線；四唑藍(MTT)比色法進行體外藥物敏感實驗；流式細胞儀測定細胞周期分布；細胞染色體染色進行核型分析；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)一酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測細胞端粒酶活性。 結(jié)果：SWlll6／HCPT與親代細胞相比，光鏡下形態(tài)未發(fā)生明

2、顯改變，生長曲線無明顯改變；體外藥物敏感實驗顯示：耐藥細胞對HCPT的耐藥倍數(shù)增加120倍，對阿霉素耐藥倍數(shù)增加48.2倍，對氧化苦參堿耐藥倍數(shù)增加2.1倍，對阿糖胞苷耐藥倍數(shù)增加2.O倍，對5-氟尿嘧啶耐藥倍數(shù)增加1.8倍，對順鉑耐藥倍數(shù)增加1-3倍，與多種化療藥物存在交叉耐藥現(xiàn)象；細胞周期分布有明顯改變：G1期細胞增加，S期細胞減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；染色體核型為：非整倍體54.69，約有600[％]-70％的細胞存

3、在4號染色體和13號染色體的易位現(xiàn)象，但是與親代細胞相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；端粒酶活性無明顯改變，細胞無限增殖能力未受影響。 結(jié)論：應(yīng)用藥物濃度遞增法成功建立了人結(jié)腸癌羥基喜樹堿耐藥細胞株Swll16／HCPT，后者與多種化療藥物存在交叉耐藥現(xiàn)象。這種多藥耐藥性的改變不是因為基因的缺失，而可能是因為基因的突變，或表達量的改變所致。細胞周期的改變是腫瘤細胞對羥基喜樹堿耐藥的一種主要表現(xiàn)。人結(jié)腸癌羥基喜樹堿耐藥細胞株SWll16／H

4、CPT是研究消化道腫瘤多藥耐藥現(xiàn)象的理想模型。 目的：探討結(jié)腸癌羥基喜樹堿耐藥細胞株SWlll6／HCPT株中耐藥相關(guān)基因的表達情況，為多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)選擇靶位點。 方法：抽取細胞總RNA，應(yīng)用腫瘤藥物耐受功能分類基因芯片篩選差異表達的耐藥相關(guān)基因；采用RT-PCR法對篩選出的耐藥相關(guān)基因的表達情況進行驗證。 結(jié)果：SWlll6／HCPT與親代細胞相比，耐藥細胞株表達改變的基因有30個，其中表達F調(diào)10個，上調(diào)20

5、個。這些表達改變的基因分別屬于藥物代謝基因、耐藥轉(zhuǎn)運蛋白基因、DNA修復(fù)基因、細胞周期基因、生長因子受體基因、激素受體基因、生長因子基因等。在驗證的SWlll6／HCPT細胞8個耐藥相關(guān)基因中，2個(CYPlA2、PPARA)表達下調(diào)，4個(APC、BRCAl、EIKl、BCRP、和P19)表達上調(diào)，還有2個(BRCAl、MDRI)表達無明顯改變，其中BCRP基因的表達改變最明顯。 結(jié)論：SWlll6／HCPT細胞中存在多種耐藥

6、相關(guān)基因表達的改變，各種耐藥轉(zhuǎn)運蛋白的表達升高，細胞受損DNA的修復(fù)能力增強。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物的表達升高是腫瘤細胞周期改變(G0／G1期細胞增加、S期細胞減少)的主要原因。BCRP基因在耐藥細胞中表達升高近90倍，選擇它作為逆轉(zhuǎn)耐藥的靶位點。 目的：探討結(jié)腸癌羥基喜樹堿多藥耐藥現(xiàn)象的逆轉(zhuǎn)策略。 方法：構(gòu)建BCRP基因siRNA表達質(zhì)粒，并用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)腸癌羥基喜樹堿剛藥細胞；四唑藍(MTT)比色法進行體外藥

7、物敏感實驗；流式細胞儀測定細胞周期分布；軟瓊脂克隆形成實驗檢測腫瘤細胞體外成瘤性；RT-PCR和westen B1Ot法測定BCRP基因敲除效果。 結(jié)果：成功構(gòu)建BCRP基因siRNA表達質(zhì)粒，脂質(zhì)體法導(dǎo)入結(jié)腸癌羥基喜樹堿耐藥細胞，轉(zhuǎn)染效率約42％；與耐藥細胞相比，轉(zhuǎn)染細胞對HCPT敏感性增加，IC<,50>下降62.5％，部分逆轉(zhuǎn)了耐藥；轉(zhuǎn)染細胞周期分布有明顯改變：G1期細胞減少，S期細胞增加；轉(zhuǎn)染細胞體外成瘤性下降，形成克

8、隆體積減??；RT-PCR和Western Blot顯示，轉(zhuǎn)染細胞中BCRP基因mRNA和蛋白質(zhì)的表達下降甚至消失。 結(jié)論：siRNA表達質(zhì)?？梢杂行贸鼴CRP基因的表達，從而降低BCRP轉(zhuǎn)運蛋白的水平。降低耐藥轉(zhuǎn)運蛋白的水平可以部分恢復(fù)SWlll6／HCPT細胞對羥基喜樹堿的敏感性，并降低腫瘤細胞的體外成瘤性。siRNA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)是逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌羥基喜樹堿耐藥現(xiàn)象的一種有效手段。 目的：對結(jié)腸癌羥基喜樹堿多藥耐藥細胞(

9、SWlll6/HCPT)及其親代細胞(SWll 16)進行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，探討耐藥相關(guān)蛋白的差異表達情況，深入研究腫瘤細胞的多藥耐藥機制。 方法：培養(yǎng)羥基喜樹堿多藥耐藥細胞和親代細胞，提取蛋白質(zhì)，以固相pH梯度等電聚焦為第一向，SDS-PAGE垂直電泳為第二向進行雙向電泳(2-DE)，圖像分析軟件分析電泳圖譜，MALDI-TOF質(zhì)譜或MALDI-TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)。 結(jié)果：發(fā)現(xiàn)9個蛋白質(zhì)點在SWlll

10、6/HCPT細胞中表達量發(fā)生改變，4個蛋白質(zhì)點表達量增加，5個蛋白質(zhì)點表達量減少。以質(zhì)譜鑒定了6個蛋白質(zhì)點分別為：琥珀酸脫氫酶復(fù)合物(亞單位A)、3-磷酸甘油醛脫氫酶、泛素融合降解1相似蛋白、胞核氯離子通道蛋白、β-微管蛋白和ORF蛋白。 結(jié)論：結(jié)腸癌羥基喜樹堿多藥耐藥細胞(Swll 16/HCPT)內(nèi)存在多種耐藥相關(guān)蛋白的差異表達。耐藥細胞中無氧酵解作用減弱，線粒體有氧呼吸作用增強，泛素依賴性蛋白降解過程活躍。耐藥細胞的細胞周