降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)ALI時(shí)小鼠巨噬細(xì)胞替代激活的影響.pdf

1、巨噬細(xì)胞為免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，其在機(jī)體中執(zhí)行的功能由其特定的激活方式?jīng)Q定。巨噬細(xì)胞的激活大致分為兩種:經(jīng)典激活和替代激活。其中替代激活在炎癥反應(yīng)后期較為常見，發(fā)生替代激活的巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌多種抗炎和促修復(fù)介質(zhì)參與炎癥消退與組織修復(fù)。體外IL-4可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞替代激活，精氨酸酶-1（Arg-1）和IL-10是巨噬細(xì)胞替代激活的標(biāo)志性蛋白。在多種肺部疾病的發(fā)生、發(fā)展中均存在不同表型巨噬細(xì)胞激活的失衡。急性肺損傷(ALI)時(shí)，巨噬細(xì)胞替代

2、激活可有效調(diào)控炎癥反應(yīng)，加速ALI的損傷修復(fù)。因此，尋找促進(jìn)巨噬細(xì)胞替代激活的內(nèi)外源性物質(zhì)，對(duì)ALI時(shí)的瀑布式炎癥反應(yīng)進(jìn)行及時(shí)、有效的干預(yù)，對(duì)防治ALI的炎癥遷延、促進(jìn)損傷修復(fù)意義重要。
　　降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）是肺內(nèi)含量最為豐富的神經(jīng)肽。研究表明CGRP主要通過(guò)調(diào)控炎癥介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞趨化因子和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫功能的調(diào)節(jié)作用，但其對(duì)巨噬細(xì)胞替代激活的影響尚未見相關(guān)報(bào)道。本課題將從整體和細(xì)胞水平分別觀

3、察小鼠ALI動(dòng)物模型和LPS應(yīng)激的小鼠巨噬細(xì)胞CGRP的表達(dá)變化，并研究CGRP對(duì)IL-4誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞替代激活的影響及其可能機(jī)制。
　　目的:觀察ALI時(shí)小鼠肺組織內(nèi)CGRP mRNA表達(dá)的變化，探討CGRP對(duì)IL-4誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞替代激活的影響及其可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.動(dòng)物模型復(fù)制:腹腔注射LPS復(fù)制小鼠ALI動(dòng)物模型，采用RT-PCR法分別檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)小鼠肺內(nèi)CGRP mRNA的相對(duì)表達(dá)量。<

4、br>　　2.細(xì)胞模型復(fù)制和時(shí)效量效檢測(cè):IL-4處理小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7，ATCC: TIB-7TM)復(fù)制小鼠巨噬細(xì)胞替代激活模型，觀察CGRP對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞替代激活的影響。采用RT-PCR法檢測(cè)各組Arg-1及IL-10 mRNA的相對(duì)表達(dá)。Arg-1相對(duì)表達(dá)的時(shí)效檢測(cè):時(shí)間點(diǎn)選取IL-4處理后的0h、8h、16h和24 h，CGRP濃度為10-7M，預(yù)處理時(shí)間為1 h;Arg-1相對(duì)表達(dá)的量效檢測(cè):IL-4處理時(shí)間為24

5、 h，CGRP濃度為10-8、5×10-8、10-7和5×10-7 M，預(yù)處理時(shí)間為1h。
　　3.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制:采用鈣調(diào)蛋白信號(hào)通路阻斷劑(W7)、PKC信號(hào)通路阻斷劑(H7)、和PKA信號(hào)通路阻斷劑(H89)預(yù)處理，觀察CGRP促進(jìn)IL-4誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞Arg-1 mRNA表達(dá)的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.ALI小鼠肺內(nèi)CGRP mRNA的表達(dá)RT-PCR檢測(cè)ALI小鼠0h、8h、16h、24 h肺內(nèi)

6、CGRP mRNA水平的相對(duì)表達(dá)。結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，ALI小鼠肺內(nèi)CGRP的表達(dá)明顯增高;8h即達(dá)峰值，16h和24 h較8h時(shí)表達(dá)略微降低。
　　2.LPS應(yīng)激下小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)CGRP mRNA的表達(dá)LPS處理小鼠巨噬細(xì)胞，8h后RT-PCR檢測(cè)其CGRP mRNA的表達(dá)，與對(duì)照組相比，LPS處理明顯增加CGRP mRNA的表達(dá)量。
　　3.CGRP對(duì)IL-4誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞替代激活標(biāo)志分子Arg-1和IL-10mR

7、NA表達(dá)的影響
　　(1) Arg-1: RT-PCR結(jié)果顯示，CGRP預(yù)處理對(duì)靜息狀態(tài)小鼠巨噬細(xì)胞Arg-1 mRNA的表達(dá)無(wú)影響，但可呈時(shí)間依賴性(0、8、16、24h)和濃度依賴性(10-8、5×10-8、10-7、5×10-7 M)促進(jìn)IL-4誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞替代激活時(shí)Arg-1 mRNA的表達(dá)。
　　(2) IL-10: RT-PCR結(jié)果顯示，靜息狀態(tài)小鼠巨噬細(xì)胞IL-10mRNA表達(dá)水平較低，CGRP預(yù)處理可促

8、進(jìn)IL-4誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞IL-10 mRNA的表達(dá)。
　　4.CGRP促進(jìn)IL-4誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞Arg-1 mRNA表達(dá)的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，IL-4可促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞Arg-1 mRNA的表達(dá)，CGRP可進(jìn)一步增加其表達(dá);而鈣調(diào)蛋白信號(hào)通路阻斷劑(W7)、PKC信號(hào)通路阻斷劑(H7)和PKA信號(hào)通路阻斷劑(H89)預(yù)處理均可抑制CGRP對(duì)IL-4的促進(jìn)效應(yīng)。
　　結(jié)論: