洛鉑對(duì)喉癌細(xì)胞株Hep-2作用的初步探討.pdf

1、目的：喉癌是危害人類健康和生命的惡性腫瘤，手術(shù)及放療為其主要治療手段，但手術(shù)后患者喉失去原有的發(fā)音功能，很大程度影響喉癌病人的生活質(zhì)量及生存率。近年來隨著化療水平的提高，化療在喉癌的綜合治療中越來越占有重要的地位，比如喉癌的新輔助化療，其目的在于縮小腫瘤、使臨床分期提前、與放療或喉部分切除術(shù)結(jié)合盡可能保留喉的發(fā)音功能。喉癌因位置隱蔽，發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已到中晚期，晚期喉癌或經(jīng)手術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)的患者再次手術(shù)較為困難，單純放療只針對(duì)局部病灶，難以收到

2、理想的效果，臨床上即給予化療，以控制腫瘤的全身轉(zhuǎn)移，緩解癥狀，延長(zhǎng)生命。 鉑類是頭頸部化療的基礎(chǔ)用藥，以順鉑(cDDP)為基礎(chǔ)的化療在頭頸部腫瘤治療中研究較多，并取得了一定的療效，由于順鉑嚴(yán)重的腎毒性和消化道副作用限制了它在臨床的應(yīng)用，因此開發(fā)高效低毒的鉑類制劑一直是學(xué)者們研究的方向。洛鉑是第三代鉑類衍生物，洛鉑以其較輕的毒副作用、與順鉑不完全交叉耐藥以及較強(qiáng)的抗腫瘤活性，已初步顯示了其在腫瘤治療中的重要作用。 本實(shí)驗(yàn)以

3、喉癌細(xì)胞株Hep-2為模型，采用倒置顯微鏡、MTT比色法、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)洛鉑對(duì)喉癌細(xì)胞的增殖、周期阻滯、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白bcl-2的表達(dá)，初步探討洛鉑對(duì)喉癌細(xì)胞的增殖抑制、細(xì)胞周期改變、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)等方面的作用，為洛鉑在頭頸部腫瘤化療中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的喉癌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將實(shí)驗(yàn)分組為：①空白對(duì)照組(培養(yǎng)液)；②陰性對(duì)照組(細(xì)胞+培養(yǎng)液)

4、；③實(shí)驗(yàn)組(細(xì)胞+不同濃度洛鉑+培養(yǎng)液)；將各組分別培養(yǎng)24、48、72小時(shí)。 2倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。 3應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)洛鉑對(duì)喉癌細(xì)胞的增殖抑制情況。 4應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率的改變。 5應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法(S-P法)檢測(cè)bcl-2蛋白表達(dá)的變化。 6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)分析時(shí)先行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布計(jì)量

5、資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。組間比較先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，符合方差齊性后采用單因素方差分析的方法進(jìn)行，如差異有顯著性，進(jìn)一步LSD法進(jìn)行兩兩比較。兩樣本均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)，顯著性水平以p＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1相差顯微鏡下每日觀察對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞大小和形態(tài)的變化。陰性對(duì)照組Hep-2細(xì)胞為上皮樣，貼壁生長(zhǎng)于培養(yǎng)基質(zhì)，輪廓清晰，細(xì)胞間結(jié)構(gòu)緊密，生長(zhǎng)旺盛。5μmol/L洛鉑作用48h后可見少量細(xì)胞體積增

6、大、變圓，仍貼壁生長(zhǎng)。20μmol/L時(shí)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞逐漸減少，變圓細(xì)胞逐漸增多，脫壁漂浮的小圓球細(xì)胞及細(xì)胞碎片逐漸增多，到80μmol/L高濃度藥物作用后貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞極少，出現(xiàn)成堆漂浮的死亡細(xì)胞及細(xì)胞碎片。 2洛鉑對(duì)細(xì)胞增殖的影響：不同濃度洛鉑在同一時(shí)間A值與對(duì)照組比較，5μmol/L洛鉑作用24小時(shí)與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。同一濃度洛鉑作用24、48、72小時(shí)比較差異均有統(tǒng)計(jì)

7、學(xué)意義(p＜0.05)。洛鉑能明顯抑制喉癌細(xì)胞的增殖，抑制率隨著藥物濃度的增加而增加，有劑量依賴關(guān)系；抑制率并隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，有時(shí)間依賴關(guān)系。但是到達(dá)一定抑制率(80％左右)后，再增加洛鉑藥物濃度，抑制率增加并不明顯，呈現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)。 3.洛鉑對(duì)細(xì)胞周期的影響：同一濃度洛鉑作用24、48、72小時(shí)S期及G0/G1期與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。5μmol/L洛鉑作用24小時(shí)開始引起喉癌細(xì)胞S期比例增

8、加，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)到72小時(shí)時(shí)S期細(xì)胞比例下降，G0/G1期細(xì)胞比例增加。20μmol/L洛鉑作用24小時(shí)使細(xì)胞阻滯在S期，阻滯作用明顯，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，S期細(xì)胞比例下降，隨后出現(xiàn)明顯的G0/G1期阻滯，表明低濃度短時(shí)間內(nèi)使喉癌細(xì)胞阻滯在S期，高濃度長(zhǎng)時(shí)間可使喉癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期。 4 洛鉑對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響：正常對(duì)照組細(xì)胞無凋亡峰出現(xiàn)，5μmol/L洛鉑作用24小時(shí)后有小的凋亡峰出現(xiàn)，作用48、72小時(shí)后出現(xiàn)明顯的凋

9、亡峰，20μmol/L作用24、48小時(shí)均出現(xiàn)明顯的凋亡峰。不同濃度洛鉑作用于喉癌細(xì)胞24、48、72小時(shí)的凋亡率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，同一濃度洛鉑對(duì)喉癌細(xì)胞作用24小時(shí)、48小時(shí)凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。結(jié)果表明洛鉑可以誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞凋亡，而且隨著藥物濃度和作用時(shí)間的增加，凋亡率逐漸增加，洛鉑誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞的凋亡呈時(shí)間和劑量依賴關(guān)系，低劑量洛鉑(5μmol/L)24小時(shí)即可誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。 5 應(yīng)

10、用免疫細(xì)胞化學(xué)法(S-P法)檢測(cè)各組細(xì)胞bcl-2蛋白表達(dá)的變化；20μmol/L洛鉑作用48小時(shí)后，bcl-2表達(dá)減弱，經(jīng)t檢驗(yàn)p＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1洛鉑在體外具有抑制喉癌細(xì)胞增殖的作用，呈時(shí)間和劑量依賴性。 2.洛鉑可以對(duì)喉癌細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞周期阻滯，低濃度短時(shí)間阻滯在S期，高濃度長(zhǎng)時(shí)間可產(chǎn)生G0/G1期阻滯。 3.洛鉑能誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，呈時(shí)間和劑量依賴性，5μmol/L濃度洛