Doxycycline對(duì)人肝癌細(xì)胞系HepG-,2-增殖及凋亡的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：肝癌的發(fā)生與發(fā)展與腫瘤細(xì)胞的凋亡關(guān)系密切，因此誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的策略成為近年來肝癌治療的重點(diǎn)。Doxycycline(多西環(huán)素)為四環(huán)素類抗生素的一種，被廣泛用于多種微生物感染，已有研究表明它可對(duì)多種腫瘤有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，如結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌及前列腺癌等，但其對(duì)肝癌的作用國(guó)內(nèi)外卻未見報(bào)道。本研究通過將不同濃度Doxycyclinc作用于人肝細(xì)胞性肝癌細(xì)胞系HepG2，觀察Doxycyclinc對(duì)HepG2生長(zhǎng)增殖和凋亡的作

2、用，同時(shí)分別從蛋白及mRNA水平檢測(cè)Fas、FasL及MMP-2表達(dá)情況，進(jìn)而初步探討其可能的作用機(jī)制。 方法： 1．不同濃度的Doxycycline(5、10、20、30和50mg/L)對(duì)體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系HepG2進(jìn)行不同的時(shí)間干預(yù)(24、48和72h)，倒置顯微鏡觀察肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)并照相。 2．MTT法檢測(cè)經(jīng)Doxycycline處理過的HepG2細(xì)胞的吸光度值(OD值)，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，并繪制隨

3、藥物濃度變化的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線。 3．TUNEL，法檢測(cè)不同濃度Doxycycline(5和20mg/L)作用不同時(shí)間(24、48和72h)后細(xì)胞凋亡率的變化。 4．流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)測(cè)定不同濃度Doxycycline(5、10和20mg/L)作用不同時(shí)間(24、48和72h)對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響。 5．20mg/L Doxycycline作用HepG2細(xì)胞48h后制成細(xì)胞爬片，免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)測(cè)定

4、Fas、FasL及MMP-2蛋白在HepG2細(xì)胞的表達(dá)變化。 6．不同濃度Doxycycline(5和20mg/L)作用HepG2細(xì)胞48h后，RT-PCR方法檢測(cè)Fas、FasL及MMP-2 mRNA在HepG2細(xì)胞的表達(dá)變化。 結(jié)果： 1．不同濃度Doxycycline作用HepG2細(xì)胞48h和72h后，實(shí)驗(yàn)組大部分HepG2細(xì)胞變圓變小，胞體皺縮變形，出現(xiàn)較多的凋亡細(xì)胞，而作用24h后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)無明

5、顯變化。 2．MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同濃度Doxycycline作用48及72h HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)被明顯抑制，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)，且呈時(shí)間、濃度依賴趨勢(shì)，而作用24h后實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組變化差異并不顯著(p>0.05)。 3．20mg/L Doxycycline作用HepG2細(xì)胞48h和72h后，細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組也明顯升高(p<0.01)，同樣作用24h實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較無顯著差異(p

6、>0.05)。 4．流式細(xì)胞儀行細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組HepG2細(xì)胞發(fā)生G1-S期阻滯，S期抑制。 5．以20mg/L Doxycycline作用于HepG2細(xì)胞48h后，實(shí)驗(yàn)組FasL蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，MMP-2蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯降低，兩組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)，而實(shí)驗(yàn)組Fas蛋白表達(dá)較對(duì)照組則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。 6．5、20mg/L Doxycycline作用HepG2細(xì)

7、胞48h，同樣可見實(shí)驗(yàn)組FasL mRNA表達(dá)較對(duì)照組升高，MMP-2 mRNA表達(dá)較對(duì)照組降低，而實(shí)驗(yàn)組FasL mRNA表達(dá)較對(duì)照組不明顯。 結(jié)論： 1．Doxycycline可顯著抑制人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其凋亡。 2．Doxycycline對(duì)人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)周期產(chǎn)生明顯的G1-S阻滯，S期抑制。 3．Doxycycline可能通過上調(diào)FasL蛋白表達(dá)、下調(diào)MMP-2