大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的心肌樣細(xì)胞與心肌成纖維細(xì)胞移植治療功能性室壁瘤的研究.pdf

1、一﹑研究背景及目的
　　室壁瘤是心肌梗死的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，是由于心肌細(xì)胞壞死和膠原纖維受損，室壁無(wú)法抵抗心室收縮時(shí)的強(qiáng)大張力，從而向外膨出造成的，其主要并發(fā)癥為附壁血栓、室性心律失常、頑固性充血性心力衰竭和心臟破裂等。室壁瘤在心肌梗死患者中的發(fā)生率高達(dá)10％～38％。未治療患者5年存活率為47％[1-3]，10年存活率僅為18％。目前對(duì)室壁瘤的主要治療手段是外科手術(shù)，但其僅適于晚期解剖性室壁瘤，對(duì)于功能性室壁瘤雖可利用藥物治療改善

2、心功能和防治并發(fā)癥，但不能挽救已受損壞死心肌。近年來(lái)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)由于具有取材方便，無(wú)免疫排斥性，增殖能力強(qiáng)，多向分化潛能等優(yōu)勢(shì)，而成為修復(fù)和重建心肌的研究熱點(diǎn)。應(yīng)用BMMSCs治療心肌梗死、缺血性心臟病等初見(jiàn)成效，顯示了廣闊的臨床治療前景。而應(yīng)用干細(xì)胞移植治療功能性室壁瘤是否具有可行性，是否能夠促進(jìn)室壁瘤的修復(fù)，改善心功能，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。
　　本研究旨在通過(guò)觀察移植BMMSCs分化的心肌樣細(xì)胞和心

3、肌成纖維細(xì)胞(CFs)對(duì)大鼠功能性室壁瘤的修復(fù)作用和心功能的影響，為臨床應(yīng)用細(xì)胞移植治療功能性室壁瘤提供研究依據(jù)。
　　二﹑研究方法
　　1.BMMSCs的培養(yǎng)、誘導(dǎo)及誘導(dǎo)后鑒定：依據(jù)密度梯度離心法體外分離、培養(yǎng)大鼠BMMSCs，待細(xì)胞傳至3代，加入終濃度為10μmol/L的5-氮雜胞苷(5-aza)培養(yǎng)24h后，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)，4w后細(xì)胞用肌鈣蛋白I(cTnI)鑒定。
　　CFs的培養(yǎng)及鑒定：采用酶消化法和差速貼壁法結(jié)

4、合的方法，培養(yǎng)乳鼠CFs，并用I型膠原蛋白鑒定。
　　2.制備動(dòng)物模型：結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈前降支，結(jié)扎后左室室壁變蒼白，心電監(jiān)護(hù)可見(jiàn)R波振幅升高，表明結(jié)扎成功；4w后，超聲心動(dòng)圖可見(jiàn)左室收縮和舒張末期內(nèi)徑(LVESD、LVEDD)增大，短軸縮短率(FS)及射血分?jǐn)?shù)(EF)均降低。前間隔和前壁局部變薄，回聲增強(qiáng)，收縮功能均不同程度減弱或消失。室壁瘤部位表現(xiàn)為前壁及心尖部有隆起結(jié)構(gòu)，并和心室壁有連續(xù)性。
　　3.分組：造模成功大鼠

5、隨機(jī)分為4組(n=10)。①對(duì)照組，注射生理鹽水(100μL)；②ClCs組，移植心肌樣細(xì)胞(4×106～5×106/100μL)；③CFs組，移植CFs(4×106～5×106/100μL)；④Comb組，移植心肌樣細(xì)胞和CFs(4×106～5×106/100μL，1：1混合)。移植前，分別用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)標(biāo)記心肌樣細(xì)胞和CFs，隨后通過(guò)開(kāi)胸直視，用微量注射器將各

6、組細(xì)胞多點(diǎn)注射到室壁瘤部位及周邊，
　　4.細(xì)胞移植后評(píng)價(jià)：移植4w后，用超聲心動(dòng)圖和血流動(dòng)力學(xué)方法大鼠測(cè)定心功能相關(guān)指標(biāo)，用熒光顯微鏡觀察標(biāo)記的細(xì)胞，并通過(guò)Masson氏三色染色法測(cè)定室壁瘤范圍。
　　三﹑結(jié)果
　　1.BMMSCs接種于培養(yǎng)瓶24h后，倒置顯微鏡下可見(jiàn)瓶底有少量細(xì)胞貼壁，體小而圓，漿少核大。3～4d后細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)，為不規(guī)則形、短梭形或多角形，之后漸變?yōu)榫鶆虻募忓N形、梭形，排列緊密。5-aza誘導(dǎo)

7、后，細(xì)胞逐漸變大、變長(zhǎng)，形態(tài)不規(guī)則，2w后互相融合，形成肌管樣結(jié)構(gòu)，3w后肌管樣結(jié)構(gòu)增多，細(xì)胞走行趨向一致。4w后，細(xì)胞cTnI熒光染色陽(yáng)性。
　　CFs貼壁和生長(zhǎng)迅速，2～3d可呈融合狀態(tài)，細(xì)胞排列緊密，呈梭形，胞體和胞核較大，胞漿透明，無(wú)自發(fā)性搏動(dòng)。2w后，細(xì)胞I型膠原蛋白免疫熒光染色陽(yáng)性。
　　2.細(xì)胞移植4w后，超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，移植ClCs、CFs或Comb組移植均可降低功能性室壁瘤的LVEDD與L

8、VESD[(8.749±0.091)mm、(8.587±0.481)mm、(8.131±0.130)mmvs(9.299±0.064)mm，P＜0.05；(5.109±0.171)mm、(4.991±0.054)mm、(4.682±0.089)mmvs(5.898±0.122)mm，P＜0.05]，且聯(lián)合移植的降低程度大于單一細(xì)胞移植(P＜0.05)。此外，移植ClCs或聯(lián)合移植均可顯著增高FS及EF[(32.70±1.283)％、(3

9、3.37±0.417)％vs(22.21±0.339)％，P＜0.05；(45.78±1.796)％、(47.22±0.594)％vs(31.09±0.475)％，P＜0.05]。
　　3.血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，移植ClCs或聯(lián)合移植可明顯改善功能性室壁瘤的LVDP、(+dp/dtmax)和(-dp/dtmax)(152.9±0.669)mmHg、(163.7±2.142)mmHgvs(122.5±2.639)mmHg

10、，P＜0.05；(4109±33.86)mmHg/s、(4076±29.37)mmHg/svs(3223±73.50)mmHg/s，P＜0.05；(-3579±49.09)mmHg/s、(-3708±54.91)mmHg/svs(-2828±60.96)mmHg/s，P＜0.05]，然而，移植CFs后無(wú)明顯改善(P＞0.05)。
　　4.Masson氏法染色結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，移植ClCs、CFs或兩種細(xì)胞聯(lián)合移植均可顯著降低

11、室壁瘤范圍[(22.20±0.64)％、(22.11±0.77)％、(19.59±0.61)％vs(25.74±1.13)％，P＜0.05]，且聯(lián)合移植的降低幅度最為明顯(P＜0.05)。
　　5.熒光顯微鏡下可在ClCs組的細(xì)胞移植區(qū)觀察到有DAPI標(biāo)記的心肌樣細(xì)胞；CFs組有CFSE標(biāo)記的CFs綠色熒光的表達(dá)；Comb移植組可同時(shí)觀察到這兩種細(xì)胞，熒光細(xì)胞呈簇狀分布，細(xì)胞核形態(tài)相對(duì)規(guī)則。
　　四﹑結(jié)論
　　1.BM