大鼠腎移植術(shù)后腎小球的比較蛋白組學研究.pdf

1、目的：利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)分析大鼠同系移植組和同種異基因移植組腎移植術(shù)后腎小球蛋白質(zhì)組差異表達情況，尋找移植腎急性排斥反應相關(guān)的蛋白標志物。 方法：1.建立大鼠腎移植模型：改良Fisher等建立的經(jīng)典大鼠腎移植模型方法，進行大鼠腹腔原位腎移植手術(shù)；2。實驗動物分組：(1)同系移植組(10只)：供、受者均為雄性Sprague-Dawely(SD)大鼠；(2)同種異基因移植組(10只)：供者為雄性SD大鼠，受者為雄性Wistar大鼠。

2、實驗大鼠于造模后第3d(每組5只)和第5d(每組5只)麻醉后取移植腎臟，移植腎標本分為兩部分，一部分作病理學檢測；另一部分用來分離腎小球進行比較蛋白組學研究；3.移植腎臟病理學檢測：采用國際公認的Banff標準對移植腎臟排斥反應病理學改變程度進行分級評分；4.同系移植組和同種異基因移植組腎小球差異表達蛋白的鑒定：采用2-DE聯(lián)合MS技術(shù)路線分離、鑒定移植。腎急性排斥反應相關(guān)蛋白，即利用固相pH梯度(Immobilized pH grad

3、ient，IPG)二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(Two-dimensional electrophoresis，2-DE)分離大鼠腎移植術(shù)后3d的腎小球蛋白，考馬斯亮藍染色后經(jīng)PDQuest7.0軟件進行圖像分析識別差異表達的蛋白質(zhì)點，將增強表達的10個蛋白質(zhì)點進行膠內(nèi)酶切后，應用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass s

4、pectrometry，MALDI-TOF-MS)分析獲得差異表達蛋白的肽指紋圖譜，并用Mascot軟件在NCBInr數(shù)據(jù)庫中進行搜索、分析確定差異表達的蛋白；5.選2種差異表達的蛋白進行組織定位驗證：采用免疫組織化學方法對差異表達的蛋白的分布和表達量進行初步驗證，并分析與相同時間點(3d、5d)腎移植急性排斥反應病理學改變的相關(guān)性；6.血清中該可溶性差異表達蛋白的檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法進行檢測。 結(jié)果：1

5、.成功建立大鼠腹腔原位腎移植模型，供腎與受體鼠動靜脈吻合時間40±10min，總手術(shù)時間110±20min。2.移植腎臟病理學改變：同系移植組術(shù)后第3d，腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)、形態(tài)基本正常，偶有散在的間質(zhì)炎性細胞浸潤；術(shù)后第5d，炎性細胞浸潤數(shù)量未見增多，范圍未見明顯擴大；同種異基因移植組術(shù)后第3d，腎小球旁及小動脈周淋巴細胞浸潤，腎小管間質(zhì)散在淋巴細胞浸潤，腎小球細胞數(shù)增多：術(shù)后第5d，腎小球內(nèi)炎性細胞沿球囊向球內(nèi)浸潤，小動脈內(nèi)皮細胞脫

6、落、出血、血栓形成，亦可見小動脈壁纖維素樣壞死，腎間質(zhì)彌漫性炎細胞浸潤，腎小管細胞變性、壞死；3.同系移植組和同種異基因移植組腎小球差異表達蛋白的鑒定結(jié)果：(1)得到了分辨率較高、重復性較好的同系移植組和同種異基因移植組的術(shù)后第3d的腎小球蛋白雙向凝膠電泳圖譜(17cm IPG膠條pH 3-10)；(2)比較分析同系移植組和同種異基因移植組移植后腎小球雙向凝膠電泳圖譜，找到差異蛋白質(zhì)點24個(6個點表達降低，18個點表達增高)；(3)對

7、其中10個差異蛋白質(zhì)點進行了肽指紋圖譜(Peptide mass fingerprint，PMF)分析，獲得了8個差異表達蛋白的肽指紋圖譜；經(jīng)生物信息學方法分析確定了5種差異(增強)表達的蛋白：電壓依賴性陰離子通道，3-磷酸甘油醛脫氫酶，Cofilin，CD44和熱休克蛋白90(Heat shock protein 90，HSP90)。4.CD44和熱休克蛋白90(Heat shock protein 90，HSP90)在移植。腎組織的

8、表達：免疫組織化學染色結(jié)果顯示，同系移植組未見血管內(nèi)皮表達CD44，移植腎皮質(zhì)僅包曼氏囊壁層上皮細胞、腎小管及其間質(zhì)少量表達CD44分子，同種異基因移植組移植腎皮質(zhì)和髓質(zhì)的。腎小球、小血管內(nèi)皮、腎小管和間質(zhì)均高表達CD44分子；同系移植組移植腎組織腎小管和。腎小球毛細血管內(nèi)皮細胞微弱表達HSP90；同種異基因移植組移植腎小血管內(nèi)皮細胞、腎小球強烈表達HSP90，且表達量與移植腎組織病理學損害程度相關(guān)；5.血清CD44和HSP90水平：E

9、LISA結(jié)果顯示同種異基因移植組術(shù)后第3d和第5d的血清CD44和HSP90水平較同系移植組明顯升高(P＜0.05)，同種異基因移植組術(shù)后第5d組血清CD44水平雖高于第3d組，但差異不顯著(P＞0.05)；同種異基因移植組術(shù)后第5d組血清HSP90水平明顯高于3d組(P＜0.05)。 結(jié)論：發(fā)現(xiàn)大鼠腎移植急性排斥時腎小球差異表達的蛋白點有24個，其中6個點表達降低1 8個點表達增高，經(jīng)肽指紋圖譜鑒定和Mascot軟件在NCBI

10、nr數(shù)據(jù)庫中分析后確定了5種腎移植急性排斥反應相關(guān)蛋白，從中選出的CD44和HSP90經(jīng)免疫組織化學方法驗證在急性排斥反應早期(術(shù)后第3d)即可高表達于腎小球，且HSP90表達量與腎移植排斥反應病理損害程度相關(guān)，同種異基因移植組血清CD44和HSP90水平也較同系移植組明顯升高，因此，初步確定CD44和HSP90為腎移植急性排斥反應的候選標志蛋白。本實驗結(jié)果為CD44和HSP90作為監(jiān)測指標用于腎移植急性排斥反應的診斷研究提供了理論和實