絲氨酸蛋白酶抑制劑基因spink3對肝癌細胞株BEL-7402的作用研究.pdf

1、絲氨酸蛋白酶抑制劑KazalⅢ型(serine protease inhibitor，Kazal type3，SPINK3)是一種胰蛋白酶抑制劑，在胰腺癌、大腸癌，乳腺癌、前列腺癌、肝癌等多種腫瘤中高表達，但其對肝癌細胞株的作用研究尚未見報道。
　　為此，本文構(gòu)建了.spmk3基因的表達載體(pEGFP-N1-spink3)，干涉載體(pGenesil-1.0-spink3(123)和pGenesil-1.0-spink3(143

2、))和檢驗載體(pGenesil-1.0-spink3(123)-spink3、spmk3(143)-spmk3和-HK-spmk3)。將各檢驗載體進行尾靜脈液壓轉(zhuǎn)基因至小鼠肝臟，用熒光顯微技術(shù)觀察與SPINK3融合表達的增強型綠色熒光蛋白(enhanced greenfluorescent protein，EGFP)的陽性細胞率，篩選出最佳干涉載體。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將4種質(zhì)粒(表達載體pEGFP-N1-spink3及其對照pEGFP-

3、N1，最佳干涉載體pGenesil-1.0-spink3(123)及其對照pGenesil-1.0-HK)轉(zhuǎn)染肝癌細胞株BEL-7402，并用G418選擇性培養(yǎng)基篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。對正常BEL-7402細胞株和上述篩選出來的四種穩(wěn)定細胞株用下列方法進行檢測：通過HE染色觀察細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)；熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)以及EGFP分布；通過計數(shù)法和普通MTT法繪制細胞的生長曲線；通過PCNA細胞免疫化學檢測細胞中PCNA的表達變化；通過Ho