高糖對(duì)血管平滑肌細(xì)胞凋亡與增殖的影響及干預(yù)研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)旨在探討與正常濃度葡萄糖相比，高濃度葡萄糖培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmoothmusclecells，VSMCs)凋亡調(diào)控基因bcl-2的表達(dá)變化及其與細(xì)胞凋亡和增殖的關(guān)系，并探討應(yīng)用天然植物成分白藜蘆醇(resveratrol，Res)和RNA干擾技術(shù)抑制bcl-2的表達(dá)進(jìn)而干預(yù)VSMCs凋亡與增殖的效果，以期為糖尿病血管并發(fā)癥的防治提供新的思路。 第一部分高糖對(duì)血管平滑肌細(xì)胞凋亡與增殖的影響研究

2、目的：探討與正常濃度葡萄糖相比，高濃度葡萄糖培養(yǎng)的VSMCs凋亡調(diào)控基因bcl-2的表達(dá)變化及其與細(xì)胞凋亡和增殖的關(guān)系。方法：體外組織貼塊法培養(yǎng)VSMCs，分為正常濃度葡萄糖組(5.5mmol/L葡萄糖)、甘露醇高滲對(duì)照組(即5.5mmol/L葡萄糖+19.5mmol/L甘露醇)和高濃度葡萄糖組(25mmol/L葡萄糖)，分別培養(yǎng)72小時(shí)后，以熒光實(shí)時(shí)定量PCR、Westernblotting法檢測(cè)bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平，流

3、式細(xì)胞儀檢測(cè)VSMCs的早期凋亡狀況，MTT比色法檢測(cè)VSMCs的增殖狀況。結(jié)果：家兔VSMCs培養(yǎng)成功；與正常濃度葡萄糖組和甘露醇高滲對(duì)照組相比，高濃度葡萄糖組bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著增強(qiáng)(P<0.05)，細(xì)胞凋亡減少、增殖增加，而前兩組相互比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：高濃度葡萄糖使VSMCs的抗凋亡基因bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡減少，增殖增加，而且該作用與滲透壓的變化無(wú)關(guān)。 第二部分白藜蘆醇干預(yù)

4、高糖培養(yǎng)的VSMCs凋亡與增殖的研究 目的：探討不同濃度的Res干預(yù)體外高糖培養(yǎng)的VSMCs凋亡與增殖狀況的效果。方法：配制含有不同濃度Res的培養(yǎng)基，將高糖培養(yǎng)72h的VSMCs分為四組，即高糖對(duì)照組、高糖+50μmol/LRes組、高糖+100μmol/LRes、高糖+150μmol/LRes組，分別培養(yǎng)48小時(shí)，以熒光實(shí)時(shí)定量PCR、Westernblotting法檢測(cè)bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)VS

5、MCs的早期凋亡狀況，MTT比色法檢測(cè)VSMCs的增殖狀況。結(jié)果：與高糖對(duì)照組相比，三個(gè)白藜蘆醇干預(yù)組bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著減低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡增加，增殖減少，而且，隨Res濃度增加，該作用增強(qiáng)。結(jié)論：Res可顯著抑制高糖培養(yǎng)的VSMCs的bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)，并使細(xì)胞凋亡增加，增殖減少，在一定范圍內(nèi)，該作用呈現(xiàn)濃度依賴性。 第三部分shRNA抑制高糖培養(yǎng)的VSMCsbcl-2表達(dá)的研究

6、 目的：構(gòu)建靶向家兔bcl-2基因的shRNA質(zhì)粒載體，探討體外RNA干擾技術(shù)抑制bcl-2基因表達(dá)的效果，并篩選相對(duì)高效的shRNA質(zhì)粒。方法：構(gòu)建靶向家兔bcl-2基因的2個(gè)shRNA質(zhì)粒載體，將高糖培養(yǎng)72h的VSMCs分為五組，即高糖對(duì)照組、高糖+轉(zhuǎn)染劑Lipofectamine組、高糖+pHK-shRNA陰性質(zhì)粒對(duì)照組、高糖+pbcl-21-shRNA質(zhì)粒干預(yù)組和高糖+pbcl-22-shRNA質(zhì)粒干預(yù)組，分別轉(zhuǎn)染VSMC

7、s，48小時(shí)后，以熒光實(shí)時(shí)定量PCR、Westernblotting法檢測(cè)bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：pbcl-2-shRNA質(zhì)粒載體構(gòu)建成功：與高糖對(duì)照組、Lipofectamine組和pHK-shRNA陰性質(zhì)粒對(duì)照組相比，兩個(gè)pbcl-2-shRNA質(zhì)粒干預(yù)組bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著減低(P<0.05)，其中，pbcl-21-shRNA質(zhì)粒干預(yù)組更為明顯。結(jié)論：應(yīng)用成功構(gòu)建的bcl-2-shRNA質(zhì)粒載