基于細(xì)菌16S rRNA序列的中醫(yī)舌苔類型分析及其應(yīng)用.pdf

1、舌診是中醫(yī)診斷學(xué)的一個(gè)重要組成部分。該診斷方法根據(jù)舌苔的顏色、腐膩、厚薄程度等，將舌苔分為不同的類型，然后利用舌苔類型判斷病人的健康狀況。然而，舌苔的形成機(jī)制，如舌苔為什么會(huì)在不同健康狀況下發(fā)生變化，影響這些變化的關(guān)鍵因素是什么，目前仍未被闡明。已有研究表明，細(xì)菌在舌苔的形成中發(fā)揮了重要作用。因此，探討不同中醫(yī)舌苔類型的舌苔菌群結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，有助于更深入地揭示舌苔形成原理，促進(jìn)中醫(yī)舌診的客觀化和標(biāo)準(zhǔn)化。另外，肺癌是我國(guó)主要的惡性腫瘤，

2、所以本課題主要以肺癌病人中醫(yī)舌苔類型和舌苔菌群結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系為研究對(duì)象。
　　 在采集了多例健康者（薄白苔）和具有不同中醫(yī)舌苔類型（薄白苔、白膩苔、黃膩苔，黃厚苔，薄灰黃膩苔）的肺癌病人的舌苔樣本之后，我們采用變性凝膠梯度電泳（DGGE）技術(shù)對(duì)樣本進(jìn)行了分析與比較：提取每個(gè)樣本的舌苔細(xì)菌總DNA，PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因V3區(qū)，DGGE分離擴(kuò)增產(chǎn)物，并利用Bionumerics軟件分析同一種中醫(yī)舌苔類型的不同個(gè)體間的舌

3、苔菌群結(jié)構(gòu)的組內(nèi)相似性，發(fā)現(xiàn)相同中醫(yī)舌苔類型的舌苔菌群結(jié)構(gòu)具有較高的相似性（43.2％-93.3％）。
　　 為了探明不同中醫(yī)舌苔類型的具體菌群結(jié)構(gòu)，我們又挑選了舌苔菌群結(jié)構(gòu)相似度較高的2例薄白苔肺癌病人的舌苔樣本和2例白膩苔肺癌病人的舌苔樣本，進(jìn)行SOLiD高通量測(cè)序分析。SOLiD測(cè)序儀是新發(fā)展起來的一種通量高速度快（60G/run/6-7天）成本相對(duì)較低的測(cè)序儀，但該儀器測(cè)序閱讀長(zhǎng)度只有35bp-70bp，因此到目前為止，

4、還未見采用該儀器測(cè)序16SrRNA基因的文章報(bào)導(dǎo)。我們首先提出多組PCR與SOLiD測(cè)序儀分析相結(jié)合的技術(shù)。在該技術(shù)中，我們從人類口腔微生物數(shù)據(jù)庫(kù)（Human Oral Microbiome Database，http：//www.homd.org/）中挑選了大量的16S rRNA基因序列，采用MEGA4.0.2軟件和Primer5.0軟件，針對(duì)不同菌群所特有保守區(qū)和可變區(qū)設(shè)計(jì)引物，共設(shè)計(jì)26對(duì)引物。并在每組引物前增加了限制性內(nèi)切酶Ec

5、o57I的酶切識(shí)別位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物經(jīng)Eco57I酶切后，用T4聚合酶削平酶切產(chǎn)物的3’-末端，余4個(gè)引物堿基作為引物識(shí)別標(biāo)簽。
　　 采用該技術(shù)，我們成功測(cè)序和分析了前面挑選出的4個(gè)樣本。其中，這4個(gè)樣本測(cè)序量為1.4G，共產(chǎn)生了42，647，004個(gè)reads。有398，703個(gè)reads與reference唯一匹配。我們把唯一匹配的數(shù)據(jù)進(jìn)行舌苔菌群結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明，2例薄白苔肺癌病人的舌苔菌群結(jié)構(gòu)相似性較高，而2例白膩苔肺