癲癇引起認(rèn)知功能障礙與海馬NR2B表達(dá)的變化.pdf

1、目的：癲癇是由多種原因引起的慢性腦功能障礙綜合癥，是神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)病。癲癇患者除癲癇發(fā)作外，常伴有注意力分散、學(xué)習(xí)記憶能力減退等認(rèn)知功能受損的表現(xiàn)。其中學(xué)習(xí)記憶能力減退是癲癇患者認(rèn)知障礙中最常見(jiàn)的癥狀，越來(lái)越引起人們的重視。但是由于其機(jī)制還不清楚，所以在臨床工作中還找不到行之有效的方法來(lái)防治癲癇引起的認(rèn)知障礙。我們利用戊四氮(pentylenetetrazole,PTZ)慢性癲癇動(dòng)物模型，觀察慢性點(diǎn)燃癲癇大鼠腦電圖和學(xué)習(xí)記憶能力的改變，并

2、運(yùn)用免疫組織化學(xué)和反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)方法觀察其海馬N-甲基-D-天門冬氨酸受體(N-methyl-D-asparateReceptors,NMDA)受體的2型受體(NR2)B亞單位(NMDAreceptor 2B,NR2B)，的表達(dá)變化，對(duì)癲癇引起的認(rèn)知功能障礙的機(jī)理進(jìn)行探討，為臨床實(shí)踐提供理論基礎(chǔ)。 方法： 1.造模 采用戊四氮腹腔注射慢性點(diǎn)燃癲癇(chronic epilepsy，CEP)模型，選取經(jīng)Y迷宮篩

3、選合格的清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠100只，實(shí)驗(yàn)起始質(zhì)量200±20 g，12h光亮/黑暗條件、22～25℃環(huán)境溫度，分籠喂養(yǎng)。隨機(jī)分為兩組：慢性癲癇組(chronic epilepsy goup，CEP組)60只，正常對(duì)照組(normal control goup，NC組)40只。CEP組大鼠每日晨8:00～9:00腹腔注射PTZ 35 mg/kg，連續(xù)30天，每天注射完畢后觀察1小時(shí)。NC組大鼠給予同等劑量、

4、同等次數(shù)的生理鹽水。依據(jù)Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將大鼠行為分為6級(jí)。0級(jí)：無(wú)任何反應(yīng)；Ⅰ級(jí)：胡須動(dòng)、面肌抽動(dòng)；Ⅱ級(jí)：點(diǎn)頭、咀嚼或濕狗樣抖動(dòng)(wet dog shakes,WDS)；Ⅲ級(jí)：一側(cè)前肢抬起、陣攣；Ⅳ級(jí)：站立伴有雙側(cè)前肢陣攣；V級(jí)：跌倒、全身強(qiáng)直陣攣性發(fā)作。完全點(diǎn)燃的標(biāo)準(zhǔn)是獲得連續(xù)3次Ⅳ級(jí)或以上的運(yùn)動(dòng)驚厥。 2 腦電圖將大鼠麻醉后固定于腦立體定位儀上，將電極放置于雙側(cè)皮質(zhì)和雙側(cè)海馬部位，按上述模型分組描記腦電圖。 3.行為學(xué)

5、檢測(cè)應(yīng)用Y迷宮、水迷宮、檢測(cè)大鼠癲癇前后學(xué)習(xí)記憶及情感反應(yīng)能力的變化。 4 免疫組織化學(xué)染色行為學(xué)檢查后，分別隨機(jī)選取模型組和對(duì)照組大鼠各8只在水合氯醛深度麻醉下灌注，取腦固定，常規(guī)包埋，標(biāo)本冠狀位石蠟切片。經(jīng)抗原修復(fù)、羊血清封閉后，加多克隆抗體，再經(jīng)二抗、三抗孵育，DAB顯色后置顯微鏡下觀察記錄。 5 逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)行為學(xué)檢查后，分別隨機(jī)選取模型組和對(duì)照組大鼠各8只，迅速分離海馬，經(jīng)提取海馬總RNA、逆轉(zhuǎn)錄合成cD

6、NA、引物擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像系統(tǒng)掃描定量并攝像電泳條帶的灰度，凝膠圖象分析系統(tǒng)分析結(jié)果。 結(jié)果： 1.動(dòng)物模型制備CEP組大鼠在連續(xù)注射第6～10天起開(kāi)始出現(xiàn)凝視、點(diǎn)頭、反復(fù)洗臉動(dòng)作、面部及頭部抽搐等，以后發(fā)作癥狀逐日加重，于給藥第18～24天全部出現(xiàn)全身肌陣攣、雙前肢抬起，最終發(fā)生全身強(qiáng)直.陣攣性發(fā)作，伴有跌倒、翻滾及流涎，達(dá)到RacineⅣ～V級(jí)的點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)，繼續(xù)給藥至30天。NC組動(dòng)物均無(wú)

7、癲癇發(fā)作表現(xiàn)。 2.腦電圖結(jié)果NC組表現(xiàn)為基本波動(dòng)為9-11Hzα節(jié)律，低、中輻兩側(cè)對(duì)稱CEP組大鼠發(fā)作間期的腦電圖表現(xiàn)為基本波動(dòng)為低幅的9-11Hzα節(jié)律，陣發(fā)性出現(xiàn)癇性放電，表現(xiàn)為高幅多棘綜合波，持續(xù)1-2秒。 3.行為學(xué)檢測(cè)3.1水迷宮試驗(yàn)癲癇后，CEP組大鼠逃避潛伏期第1天與對(duì)照組比較，無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，第2天高于對(duì)照組(P＜0.05)，第3天差異更為顯著(P＜0.01)。120秒內(nèi)為搜尋平臺(tái)而穿越平

8、臺(tái)區(qū)域的次數(shù)明顯低于NG組(P＜0.01)，在平臺(tái)所在象限的游泳時(shí)間與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 3.2 Y迷宮試驗(yàn)CEP組與對(duì)照組比較大鼠的錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)增多(P＜0.05)，但全天總反應(yīng)時(shí)間，兩組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 4 免疫組化結(jié)果CEP組海馬CA3區(qū)NR2B陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目較對(duì)照組顯著減少(P＜0.01)。 5 逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)CEP組NR2B mRNA表達(dá)水平低于相應(yīng)