p63與大鼠全腦缺血后神經(jīng)元凋亡的關(guān)系及肢體缺血后處理的干預(yù).pdf

1、目的:缺血性腦卒中是臨床常見(jiàn)的急性腦血管疾病,具有高發(fā)病率、高致殘率和高致死率的特點(diǎn),因此,以各種動(dòng)物模型來(lái)模擬臨床腦血管疾病,并對(duì)其發(fā)病機(jī)制和防治所進(jìn)行的研究倍受關(guān)注。本課題擬建立大鼠窒息性心跳驟停全腦缺血／再灌注模型,觀察全腦缺血／再灌注后大鼠神經(jīng)行為學(xué)、p63表達(dá)的變化及其與全腦缺血／再灌注后神經(jīng)元凋亡的關(guān)系,以及肢體缺血后處理對(duì)全腦缺血／再灌注后p63表達(dá)和神經(jīng)元凋亡的影響,從而探討p63是否參與全腦缺血／再灌注后神經(jīng)元凋亡的調(diào)

2、控,肢體缺血后處理是否具有腦保護(hù)作用,為進(jìn)一步研發(fā)相應(yīng)的抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、死亡的新藥,對(duì)腦缺血、腦梗塞的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:雄性SD大鼠120只,隨機(jī)分為三組:假手術(shù)(Sham)組、全腦缺血／再灌注(global cerebral ischemia／reperfusion,I／R)組和肢體缺血后處理(limb ischemic postconditioning,LIPC)組,每組40只。所有大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉滿意后

3、,分離股動(dòng)脈置管接生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)動(dòng)脈壓,并行氣管插管。Sham組不夾閉氣管導(dǎo)管,也不阻斷股動(dòng)脈。I／R組待生命體征平穩(wěn)后夾閉氣管導(dǎo)管,心跳停止4分鐘后行心肺復(fù)蘇,制作窒息性心跳驟停全腦缺血／再灌注模型；LIPC組夾閉氣管導(dǎo)管,待心跳停止4分鐘后行心肺復(fù)蘇,復(fù)蘇成功后用血管夾阻斷雙側(cè)股動(dòng)脈10min造成肢體缺血,松開(kāi)血管夾再灌注10min,反復(fù)3次。各組分別在手術(shù)后6h、12h、24h、48h、72h處死取腦,各時(shí)相每組8只大鼠。運(yùn)

4、用Longa的五分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定大鼠神經(jīng)行為學(xué),免疫組化染色檢測(cè)海馬CA1區(qū)p63蛋白的表達(dá)、脫氧核苷酸介導(dǎo)的原位末端標(biāo)記(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)法檢測(cè)神經(jīng)元凋亡情況,以及病理切片HE染色觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,并測(cè)定神經(jīng)元密度(Neuronal density,ND)。
　　 結(jié)果:1.本實(shí)驗(yàn)共有23只大鼠被剔除,其中16只復(fù)蘇失敗,7只未造成嚴(yán)重腦缺血,經(jīng)及時(shí)

5、補(bǔ)充,共有120只大鼠進(jìn)入結(jié)果分析。2.各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分:Sham組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分為0分；I／R組術(shù)后24h、48h和72h神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分分別為2.2±0.7、2.6±0.5和1.4±0.5分,較Sham組同時(shí)相明顯增高(p<0.01),其中48h最高,72h降低,與24h比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；LIPC組術(shù)后24h、48h和72h神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分分別為1.1±0.8、1.2±1.0和0.4±0.5分,較I／R組同時(shí)相

6、明顯降低(p<0.05),但高于Sham組(p<0.01),LIPC組內(nèi)48h評(píng)分高于72h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。I／R組和LIPC組全腦缺血／再灌注后6h和12h評(píng)分均為0分。3.p63蛋白結(jié)果:Sham組p63表達(dá)率≤5％,視為陰性表達(dá)；I／R組p63表達(dá)在術(shù)后12h、24h、48h和72h陽(yáng)性表達(dá)率為13.0±4.9、45.6±8.2、70.6±9.2和61.5±7.4,與Sham組同時(shí)相相比,p63陽(yáng)性表達(dá)率均顯著

7、升高(p<0.01),組內(nèi)48h陽(yáng)性表達(dá)率高于24h和72h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)；LIPC組術(shù)后12h、24h、48h和72h陽(yáng)性表達(dá)率為12.4±2.6、34.8±5.5、47.7±5.9和39.7±7.3,與I／R組同時(shí)相相比,p63表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),但較Sham組增高(p<0.01),組內(nèi)比較術(shù)后48h陽(yáng)性表達(dá)率高于24h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。I／R組和LIPC組全腦缺血／

8、再灌注后6h p63陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p>0.05)。4.神經(jīng)元凋亡結(jié)果:Sham組大鼠海馬CA1區(qū)可見(jiàn)極少量凋亡細(xì)胞；I／R組細(xì)胞凋亡指數(shù)在術(shù)后24h、48h和72h分別為14.8±3.4、17.7±1.8和15.1±1.2,與Sham組相比有增加(p<0.05),其中術(shù)后48h比24h、72h高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；LIPC組術(shù)后24h、48h和72h凋亡細(xì)胞指數(shù)分別為12.1±1.4、13.9±3.0和13.

9、0±1.40,與I／R組同時(shí)相比較,凋亡細(xì)胞指數(shù)減少,且高于Sham組(p<0.05),組內(nèi)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。I／R組和LIPC組全腦缺血／再灌注后6h、12h凋亡細(xì)胞指數(shù)組內(nèi)和組間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p>0.05)。5.組織學(xué)及神經(jīng)元密度改變:Sham組海馬CA1區(qū)組織學(xué)分級(jí)(Histological grade,HG)0～Ⅰ級(jí),術(shù)后6h、12h、24h、48h和72h神經(jīng)元密度分別為:221±8.7、219±6

10、.3、222±8.5、218±6.0和214±4.7n／mm2,組內(nèi)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。I／R組組織學(xué)分級(jí)Ⅱ～Ⅲ級(jí),高于Sham組(p<0.01)。I／R組神經(jīng)元密度24h、48h和72h分別為153±10.8、126±12.6和133±10.5n／mm2,與Sham組相比,同時(shí)相神經(jīng)元密度有減少(p<0.01),48h和72h神經(jīng)元密度低于24h(p<0.05)。LIPC組組織學(xué)分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí),術(shù)后24h、48h和72

11、h神經(jīng)元密度分別為167±7.4、149±14和159±12 n／mm2,較Sham組同時(shí)相有減少(p<0.01),但高于I／R組同時(shí)相神經(jīng)元密度(p<0.05),組內(nèi)比較術(shù)后48h低于24h和72h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。I／R組和LIPC組全腦缺血／再灌注后6h、12h凋亡細(xì)胞指數(shù)組內(nèi)和組間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
　　 結(jié)論:1.p63在全腦缺血／再灌注后表達(dá)增加,呈先增加后減少的趨勢(shì),即在術(shù)后