二十碳五烯酸抑制角膜新生血管的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、角膜病占致盲病的第二位，角膜熱化學(xué)燒傷、感染性角膜炎等是常見角膜病，在其發(fā)生發(fā)展過程中，角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)起著重要作用，常導(dǎo)致嚴(yán)重的視力下降，同時(shí)，角膜新生血管破壞了角膜的相對(duì)“免疫赦免”狀態(tài)，是角膜移植發(fā)生排斥反應(yīng)的高危險(xiǎn)因素。角膜新生血管的發(fā)生機(jī)制和治療是角膜病研究的熱點(diǎn)。
　　 角膜新生血管的發(fā)生機(jī)制有細(xì)胞因子平衡學(xué)說和炎癥學(xué)說。細(xì)胞因子平衡學(xué)說是指在正常情況下，血

2、管形成促進(jìn)因子和抑制因子處于平衡狀態(tài)，使角膜保持透明無血管性。一旦炎癥刺激等誘因存在時(shí)，平衡被打破導(dǎo)致角膜新生血管的產(chǎn)生。在眾多的血管形成促進(jìn)因子中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是最主要的促血管生成因子，VEGF通過與其特異性受體，特別是(fetal liver kinase1，F(xiàn)lk-1)Flk-1結(jié)合，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、移行和血管管腔的形成，發(fā)揮其促血管生成

3、作用。炎癥學(xué)說是指炎癥在新生血管的形成過程中起著直接和間接的作用。白細(xì)胞介素1α（interleukin1α，IL-1α）和白細(xì)胞介素6(interleukin6，IL-6)是重要的致炎細(xì)胞因子，核轉(zhuǎn)錄因子kB(nuclear factor kappa B，NF-κB)廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞中，是調(diào)控炎癥反應(yīng)的核心因子，調(diào)控靶基因生長(zhǎng)因子如VEGF、細(xì)胞因子如IL-1α、IL-6的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥、細(xì)胞的增殖等。
　　 目前治療角

4、膜新生血管的方法不理想。光凝、光動(dòng)力治療會(huì)損害正常組織、短期內(nèi)有效；角膜緣干細(xì)胞自體移植術(shù)僅適用于單側(cè)眼或雙眼局限性角膜緣受損的病例；異體角膜緣干細(xì)胞移植術(shù)存在移植排斥反應(yīng)和角膜新生血管再發(fā)生的問題；單用羊膜移植不能完全重建眼表。因此，探索新的預(yù)防和治療角膜新生血管方法很有必要。
　　 VEGF，IL-1α和IL-6在角膜堿燒傷中高表達(dá)，血管內(nèi)皮細(xì)胞是新生血管因子作用的主要靶細(xì)胞，單個(gè)核細(xì)胞是參與急性和慢性炎癥的重要炎癥細(xì)胞。脂

5、多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞膜上的主要成分，能促進(jìn)多種細(xì)胞分泌致炎細(xì)胞因子。二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）是一種多不飽和脂肪酸，主要來源于魚油，有其抗腫瘤和抗炎癥等報(bào)道，未見EPA在角膜新生血管治療中的報(bào)道。本課題以角膜新生血管的發(fā)生機(jī)制中的兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)VEGF和炎癥為切入點(diǎn)，模擬角膜新生血管病理狀態(tài)的體外環(huán)境，通過NaOH堿燒傷獲得SD大鼠角膜新生血管模型。

6、通過體外實(shí)驗(yàn)、EPA毒性試驗(yàn)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，研究EPA對(duì)角膜新生血管的抑制作用、作用機(jī)制及安全性。
　　 第一部分二十碳五烯酸抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細(xì)胞增生作用的研究
　　 目的：探討EPA對(duì)VEGF誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增生的抑制作用。
　　 方法：HUVEC株培養(yǎng)和傳代并用Ⅷ因子相關(guān)抗原多克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。用MTT法檢測(cè)不同質(zhì)量濃度的EPA作用不同時(shí)間后對(duì)非VEGF誘導(dǎo)及VE

7、GF誘導(dǎo)的HUVEC增生的抑制率；用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EPA對(duì)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞周期的影響；應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)EPA對(duì)VEGF受體2(Flk-1)在HUVEC中表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：培養(yǎng)和傳代的HUVEC呈紡錘形及鵝卵石樣排列，鑒定Ⅷ因子相關(guān)抗原呈陽性反應(yīng)。6個(gè)質(zhì)量濃度組的EPA對(duì)VEGF誘導(dǎo)及非VEGF誘導(dǎo)的HUVEC的增生均有明顯的抑制作用，其作用呈質(zhì)量濃度依賴性(F=23.072，P=0.000)；各質(zhì)量濃度

8、組的EPA對(duì)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC的抑制作用強(qiáng)于非VEGF誘導(dǎo)的HUVEC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=41.417，P=0.000)。各質(zhì)量濃度組EPA對(duì)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC作用24、48、72h后，其細(xì)胞數(shù)逐漸降低(F=87.823，P=0.000)，但作用時(shí)間對(duì)其抑制作用無明顯影響(F=1.495，P=0.236)。EPA使VEGF誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞阻滯在G0/G1期，EPA組G0/G1期細(xì)胞數(shù)比例為（75.83±1.56）％，

9、對(duì)照組為（68.62±1.44）％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-5.88，P=0.00)；EPA組與對(duì)照組均未發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞。EPA作用后，F(xiàn)lk-1在HUVEC中的陽性染色強(qiáng)度明顯弱于對(duì)照組，F(xiàn)lk-1陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少。
　　 結(jié)論：EPA能夠通過阻止人血管內(nèi)皮細(xì)胞的DNA合成而明顯抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC的增生，其抑制作用呈劑量依賴性；EPA作用后HUVEC中Flk-1的表達(dá)下調(diào)，提示EPA可能有抗血管生成的作用。
　

10、　 第二部分二十碳五烯酸對(duì)脂多糖處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κB的表達(dá)及細(xì)胞因子分泌的影響
　　 目的：探討二十碳五烯酸(EPA)對(duì)脂多糖(LPS)處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）核轉(zhuǎn)錄因子kB(NF-kB)表達(dá)、VEGF、IL-1α和IL-6分泌的影響。
　　 方法：體外生長(zhǎng)良好的傳代HUVECs分為對(duì)照組、LPS組、0.030g/LEPA+LPS處理組、0.050g/LEPA+LPS處理組。LPS組僅加入

11、LPS進(jìn)行培養(yǎng)，EPA處理組先加入2種濃度的EPA(EPA終濃度分別為0.030g/L和0.050g/L)培養(yǎng)1h，再加入LPS進(jìn)行培養(yǎng)。LPS刺激6h、12h、24h后，收集各組上清液，ELISA檢測(cè)上清液中VEGF、IL-1α和IL-6的分泌量；LPS刺激24h后的沉淀細(xì)胞，用Western blot法檢測(cè)HUVECs NF-κ13p65的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：與對(duì)照組相比，LPS刺激后，HUVECs NF-κBp65表達(dá)

12、和VEGF、IL-1α、IL-6分泌顯著升高(P＜0.05)。EPA抑制LPS處理的HUVECs NF-κBp65的蛋白表達(dá)、VEGF、IL-1α和IL-6分泌，除LPS刺激后6h， EPA處理組IL-6的分泌量與LPS組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)外，其余差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：LPS使HUVECs NF-kB蛋白表達(dá)增加，促進(jìn)其VEGF及細(xì)胞因子表達(dá)。EPA抑制LPS處理的HUVECs NF

13、-kB的表達(dá)、VEGF、細(xì)胞因子的分泌，為EPA應(yīng)用于各種新生血管性疾病和炎癥性疾病的防治提供了理論依據(jù)。
　　 第三部分二十碳五烯酸對(duì)脂多糖誘導(dǎo)人單個(gè)核細(xì)胞NF-kB的表達(dá)及細(xì)胞因子分泌的影響
　　 目的：探討二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的人單個(gè)核細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子kB(nuclear factorkappa B，NF-kB)

14、的表達(dá)、VEGF、IL-1α和IL-6分泌的影響。
　　 方法：將人外周血單個(gè)核細(xì)胞分為對(duì)照組、LPS組、0.030g·L-1EPA處理組、0.050g·L-1EPA處理組。LPS組僅加入LPS進(jìn)行培養(yǎng)，EPA處理組先加入2種濃度的EPA(使EPA終濃度分別為0.030g·L-1和0.050g·L-1)培養(yǎng)1h，再加入LPS進(jìn)行培養(yǎng)。LPS刺激6h、12h、24h后，收集各組上清液和LPS刺激24h后的沉淀細(xì)胞，Western

15、blot法檢測(cè)人單個(gè)核細(xì)胞NF-κBp65的蛋白表達(dá)；ELISA檢測(cè)上清液VEGF、IL-1α和IL-6的分泌量。
　　 結(jié)果：LPS刺激6h后，對(duì)照組、LPS組、0.030g·L-1EPA處理組、0.050g·L-1EPA處理組VEGF含量(ng·L-1)分別為：22.57±8.86、66.49±4.21、46.18±2.35、45.49±6.61;12h后分別為：18.05±3.18、107.30±5.70、61.29±2.

16、86、54.34±7.41;24h后分別為：20.49±5.92、157.63±5.95、59.54±4.20、53.13±11.42。LPS刺激6h后IL-1α含量(ng·L-1)分別為：15.63±2.98、75.41±4.12、53.60±4.71、31.03±8.49;12h后分別為：40.37±4.51、408.00±47.93、142.80±14.65、99.17±5.86;24h后分別為：63.37±1.99、929.73

17、±27.97、322.03±101.80、161.23±14.59。LPS刺激6h后IL-6含量(ng·L-1)分別為：34.94±2.71、117.60±7.89、82.25±14.56、60.66±2.12;12h后分別為：51.00±6.65、183.60±8.64、127.37±11.48、71.61±8.16；24h后分別為：68.04±21.53、297.50±25.72、132.37±20.87、102.45±21.46。

18、與對(duì)照組相比，LPS刺激后，人單個(gè)核細(xì)胞NF-kBp65的蛋白表達(dá)和VEGF、IL-1α、IL-6分泌明顯升高。EPA抑制LPS誘導(dǎo)的人單個(gè)核細(xì)胞NF-κBp65的蛋白表達(dá)；下調(diào)其VEGF、IL-1α和IL-6分泌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(VEGF:F6h=19.147，F(xiàn)12h=77.966，F(xiàn)24h=168.237;1L-1:F6h=39.824,F12h=98.873,F24h=130.118;IL-6:F6h=26.678,F12h=

19、103.401,F24h=63.733.均為P＜0.05）。
　　 結(jié)論：LPS使人單個(gè)核細(xì)胞NF-kB蛋白表達(dá)增加，促進(jìn)其VEGF及細(xì)胞因子表達(dá)。EPA抑制LPS誘導(dǎo)的人單個(gè)核細(xì)胞NF-kB蛋白表達(dá)，下調(diào)其VEGF及細(xì)胞因子表達(dá)，為EPA應(yīng)用于各種新生血管性疾病和炎癥性疾病的防治提供了理論依據(jù)。
　　 第四部分二十碳五烯酸眼表用藥對(duì)大鼠角膜毒副作用的研究
　　 目的：研究不同劑量二十碳五烯酸大鼠球結(jié)膜下注射后的

20、角膜毒副作用。
　　 方法：18只實(shí)驗(yàn)大鼠，隨機(jī)分為3組：0.02EPA處理組、0.03EPA處理組、對(duì)照組，每組6只，右眼為實(shí)驗(yàn)眼，球結(jié)膜下分別注射0.02mg/0.04mlEPA、0.03mg/0.04mlEPA及0.04ml生理鹽水。于注藥后第1d、第4d、第7d進(jìn)行裂隙燈顯微鏡檢查，并分別摘取各組2只角膜做光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡檢查。
　　 結(jié)果：2種濃度EPA處理組各時(shí)間段眼部裂隙燈顯微鏡檢查和角膜組織學(xué)檢

21、查均正常。
　　 結(jié)論：EPA眼表局部用藥對(duì)正常角膜無毒副作用。因此，二十碳五烯酸0.03mg及以下劑量球結(jié)膜下注射治療角膜新生血管是安全可行的。
　　 第五部分二十碳五烯酸對(duì)大鼠角膜新生血管血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體表達(dá)的抑制作用
　　 目的：探討二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)對(duì)大鼠角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(V

22、EGF)及其受體Flk-1表達(dá)的影響及作用機(jī)制。
　　 方法：78只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為堿燒傷0.02mgEPA治療組(A組，24只)、堿燒傷0.03mgEPA治療組(B組，24只)、堿燒傷對(duì)照組(C組，24只)、正常組(D組，6只)，除正常組外，均選用右眼制作堿燒傷模型。A、B、C組堿燒傷后立即分別球結(jié)膜下注射0.02mg/0.04mlEPA、0.03mg/0.04mlEPA、0.04ml生理鹽水。每日裂隙燈顯微鏡下觀察

23、角膜水腫、新生血管情況。堿燒傷后1、4、7、14d，用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)角膜新生血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34表達(dá)，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及蛋白印跡法分別檢測(cè)角膜VEGF的mRNA表達(dá)及Flk-1的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：堿燒傷7d和14d，角膜新生血管相對(duì)面積A組：（15.80±6.43）％、(11.06士2.14)％，B組：（16.10±7.41）％、(11.06±2.51)％，均顯著少于C組：（84.74士7.77）

24、％、(89.63士7.50)％(P＜0.05)。堿燒傷后7d，C組CD34在CNV內(nèi)皮細(xì)胞強(qiáng)陽性表達(dá)，A、B組未見CNV內(nèi)皮細(xì)胞，CD34無表達(dá)。C組FLK-1蛋白及VEGF的mRNA表達(dá)，堿燒傷后1d最高，持續(xù)高表達(dá)至4d，隨后逐漸下降。堿燒傷4d，A、B組VEGF的mRNA表達(dá)及Flk-1的蛋白表達(dá)顯著低于C組(P＜0.05）。
　　 結(jié)論：EPA能通過VEGF途徑，抑制VEGF及其受體Flk-1的表達(dá)，從而顯著抑制角膜新生

25、血管的生長(zhǎng)。
　　 第六部分二十碳五烯酸對(duì)大鼠角膜新生血管核轉(zhuǎn)錄因子κB、細(xì)胞因子表達(dá)的抑制作用
　　 目的：探討二十碳五烯酸(EPA)對(duì)堿燒傷大鼠角膜新生血管核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)、IL-1α、IL-6表達(dá)的影響及作用機(jī)制。
　　 方法：裂隙燈觀察角膜水腫、新生血管。用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)角膜CD34表達(dá)，用RT-PCR及蛋白印跡法分別檢測(cè)角膜IL-1α、IL-6的mRNA表達(dá)及NF-κBp65的蛋白表達(dá)

26、。
　　 結(jié)果：堿燒傷7d和14d，角膜新生血管相對(duì)面積A組：（15.80±6.43）％、(11.06±2.14)％，B組：(16.10±7.41)％、(11.06±2.51)％，均顯著少于C組：（84.74±7.77）％、(89.63±7.50)％(P＜0.05)。堿燒傷后7d，C組CD34在CNV內(nèi)皮細(xì)胞強(qiáng)陽性表達(dá)，A、B組未見CNV內(nèi)皮細(xì)胞，CD34無表達(dá)。堿燒傷4d，A、B組IL-1α、IL-6的mRNA表達(dá)及NF-κB

27、p65的蛋白表達(dá)顯著低于C組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：EPA能通過NF-κB途徑，抑制NF-κB、IL-1α、IL-6的表達(dá)，從而顯著抑制角膜新生血管的生長(zhǎng)。
　　 綜合上述研究結(jié)果可以得出以下結(jié)論：二十碳五烯酸(EPA)能夠明顯抑制體外培養(yǎng)的VEGF誘導(dǎo)的HUVEC的增生和Flk-1的表達(dá)；抑制體外培養(yǎng)的LPS處理的HUVECs和LPS處理的人單個(gè)核細(xì)胞NF-kB的表達(dá)、VEGF、細(xì)胞因子IL-1α、IL-6的分