RNA干擾抑制豬肉內源性逆轉錄病毒表達及其多克隆抗體制備的研究.pdf

1、第一部分:
　　 兔抗豬內源性逆轉錄病毒P15E多克隆抗體的制備
　　 研究背景和目的:
　　 豬器官、組織和細胞作為臨床移植的供體源具有廣泛和良好的應用前景，可緩解臨床器官移植的器官相對短缺;也可為臨床治療1型胰島素依賴型糖尿病，帕金森病、亨廷頓病和癲痛病等頑固性神經疾患提供一種治療方法。豬肝細胞也可作為豬肝細胞型生物人工肝的生物成分治療急性爆發(fā)性肝炎肝功能衰竭和終末期肝功能衰竭的過渡性措施。自Dr.Clive

2、patienee(BioTransplantxnc.首席科學家)1997年報道豬內源性逆轉錄病毒(porcineendogenousretrovirus，PERV)感染體外培養(yǎng)人源細胞以來，豬異種移植或豬肝細胞型生物人工肝治療過程中可能發(fā)生PERV種間傳播的潛在危險引起眾多學者的廣泛關注。
　　 Patience等首先證實至少有三種PERV亞型在體外培養(yǎng)能夠感染人源細胞，Takeuchi和Martin等也證實PERV可以感染體外

3、培養(yǎng)的人源細胞株。
　　 1998年，DennerJ等報道逆轉錄病毒的一個結構蛋白即跨膜蛋白P15E是一個活性成分，在體內和體外可以抑制免疫反應;P15E的檢測可以作為檢測PERV表達及其是否具有感染性的一個診斷指標。國內及國際抗體市場上并未見應用于檢測PERVP15E的特異性抗體，本研究在國外報道的PERVP15E抗原位點的基礎上，設計并制作了兔抗豬PERVP15E多克隆抗體，該抗體用于檢測PERVP15E在蛋白方面的表達水平

4、具有很高的靈敏度及特異性。該抗體的研發(fā)，對檢測臨床器官移植和豬肝細胞型生物人工肝中PERV的表達和傳播具有重要意義。
　　 方法:
　　 根據(jù)文獻報告獲得了PERVP15E抗原表位E1和E2蛋白序列，再根據(jù)其蛋白序列反推獲得了P15EE1和E2的核酸序列。P15E核酸序列最小長度317bp，為增強其抗原性以及表位的完整性，我們將P15E前方100bp核酸序列一起擴增，通過PCR擴增方法擴增得到了P15E編碼區(qū)序列，然后將

5、其連接到PGEX-4T-1載體上，轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，再通過自身誘導法誘導表達重組質粒的融合蛋白通過割膠回收純化融合蛋白。免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，Westernblot和ELISA檢測抗體活性和滴度。
　　 結果:
　　 兔抗豬PERVP15E多克隆抗體可以特異性檢測P15E抗原蛋白以及豬腎細胞系PK15中P15E蛋白的表達，而人腎細胞系HEK293中則檢測不到該蛋白表達，證實本抗體特異性強。EL