內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接在電磁脈沖致血腦屏障開(kāi)放中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、電磁脈沖(ElectromagneticPulse,EMP)是一種前沿極快、頻譜較寬的短高壓脈沖，可由核爆炸以及高壓氣體開(kāi)關(guān)、特斯拉(Telsa)變壓器等強(qiáng)電場(chǎng)儀器設(shè)備產(chǎn)生。由于EMP的特殊物理特性，它的生物學(xué)效應(yīng)以及對(duì)處于這種電磁輻射環(huán)境中的工作人員或研究人員的健康危害已經(jīng)引起人們的關(guān)注。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，腦是EMP的敏感器官之一，一定條件的EMP輻照可導(dǎo)致大鼠血腦屏障(Blood-BrainBarrier,BBB)通透性增加，但其分

2、子機(jī)制尚不清楚。由于緊密連接(TightJunction,TJ)在維持BBB結(jié)構(gòu)和功能的完整性上發(fā)揮重要作用，本研究以TJ為切入點(diǎn)研究EMP致大鼠BBB開(kāi)放中的作用及其分子機(jī)制。
　　本課題以成年雄性SD大鼠為研究對(duì)象，采用白蛋白免疫組織化學(xué)、蛋白雜交、硝酸鑭示蹤透射電子顯微鏡(TransmissionElectronicMicroscope,TEM)觀(guān)察及伊文思藍(lán)(EvensBlue,EB)示蹤等方法觀(guān)察一定強(qiáng)度EMP(200k

3、V/m,200次脈沖及400次脈沖)全身輻照后大鼠BBB通透性的變化；采用蛋白雜交和免疫熒光等方法觀(guān)察EMP輻照后大鼠大腦皮層腦組織和大腦皮層微血管中TJ相關(guān)蛋白(ZO-1,occludin)和細(xì)胞骨架蛋白(actin)的表達(dá)和分布變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假輻照組相比，EMP輻照后0.5h大鼠大腦皮層BBB通透性開(kāi)始增加，輻照后3h增加最為明顯，輻照后6h開(kāi)始恢復(fù)，輻照后12h恢復(fù)至假輻照組水平；透射電鏡結(jié)果顯示硝酸鑭示蹤物主要通過(guò)微血管內(nèi)皮

4、細(xì)胞之間的TJ進(jìn)入到腦實(shí)質(zhì)，提示TJ損傷是EMP輻照后大鼠BBB通透性改變的主要原因。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，TJ蛋白ZO-1的蛋白水平在輻照后0.5h開(kāi)始下降，3h降至最低，6h開(kāi)始恢復(fù)，并且ZO-1在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞上的分布也發(fā)生了相應(yīng)改變，由原來(lái)的連續(xù)性分布變?yōu)榇闋罘植?。EMP輻照后ZO-1蛋白水平和分布的變化與BBB通透性的改變?cè)跁r(shí)間上是一致的。TJ蛋白o(hù)ccludin和細(xì)胞骨架蛋白actin的蛋白水平和分布在輻照后無(wú)明顯變化。以上

5、結(jié)果表明EMP輻照可以引起大鼠BBB通透性的可逆性改變，TJ蛋白ZO-1可能參與了EMP致BBB開(kāi)放的作用機(jī)制。
　　據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，蛋白激酶C(Protein KinaseC,PKC)與BBB的通透性及與病理狀態(tài)下BBBTJ蛋白的分布改變密切相關(guān)，為了探討EMP致BBBTJ損傷和通透性增加的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，我們采用酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)和蛋白雜交的方法檢測(cè)了EMP

6、輻照后大鼠大腦皮層腦組織和大腦皮層微血管中總PKC及其相關(guān)亞型(PKC-α和PKC-βⅡ)的蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假輻照組相比，總PKC(PKC-α、PKC-βⅠ和PKC-βⅡ)和PKC亞型PKC-βⅡ蛋白水平在輻照后0.5h和1h升高，輻照后6-12h恢復(fù)至假輻照組水平，PKC-α蛋白水平在輻照后各時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯改變。由于酶蛋白水平的變化可以間接反映酶的活性，該結(jié)果提示EMP輻照可以增加PKC及其亞型PKC-βⅡ的活性。
　　我們

7、采用PKC的特異性抑制劑(H7)預(yù)處理動(dòng)物，觀(guān)察EMP輻照后BBB通透性的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與EMP單純輻照組相比，H7預(yù)處理組大鼠EMP輻照后BBB通透性明顯降低。由于EMP輻照后可以引起B(yǎng)BB通透性增加及PKC活性增加，而抑制PKC后EMP輻照引起的BBB通透性增加得到減輕，因此可以證明PKC信號(hào)通路參與了EMP致大鼠BBB通透性增加的作用機(jī)制。
　　研究還發(fā)現(xiàn)PKC的特異性抑制劑(H7)預(yù)處理動(dòng)物后部分阻止了EMP輻照導(dǎo)致的T