COX-2及其抑制劑在幼鼠癇性發(fā)作中的作用及機制研究.pdf

1、研究背景及目的： 大量臨床回顧性研究資料表明，在伴有海馬硬化性顳葉癲癇的成人患者中有相當高比例可追問到兒童早期有長時間癇性發(fā)作史，尤其是高熱驚厥.幼年早期長時間癇性發(fā)作后大腦可塑性發(fā)生的改變對個體能產(chǎn)生長遠的影響，與海馬硬化性顳葉癲癇的形成密切相關。海馬環(huán)路內(nèi)的軸突出芽、突觸重建是顳葉癲癇的主要的病理生理特征，在顳葉癲癇的形成與維持中發(fā)揮重要作用。在癲癇形成過程中，神經(jīng)元之間形成異常的突觸聯(lián)系，建立了病理性(功能性或形態(tài)性)神經(jīng)

2、環(huán)路。海馬突觸聯(lián)系的可塑性是癲癇發(fā)生后突觸重建的基礎。癲癇發(fā)作可導致神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)增生，突觸后終端與膠質(zhì)細胞之間形成突觸，突觸后終端的樹突棘的形態(tài)學的變化引起突觸結構的改變，與膠質(zhì)細胞之間形成的突觸為異位突觸；同時癇性發(fā)作也導致異常神經(jīng)發(fā)生，引起顆粒細胞層彌散，新生的顆粒神經(jīng)元有較多的基部樹突向齒狀回投射，引起海馬內(nèi)環(huán)路性質(zhì)的變化，成為慢性反復性癇性發(fā)作的基礎。環(huán)氧合酶-2(COX-2)及其代謝產(chǎn)物在中樞起多種調(diào)節(jié)作用，與長時程突觸可塑性

3、形成和突觸重構密切相關。近年許多研究均發(fā)現(xiàn)長時間癇性活動發(fā)作后，COX-2在腦內(nèi)迅速被誘導激活，在大腦皮層、海馬、杏仁核等處廣泛表達。許多研究表明COX-2抑制劑能明顯對抗戊四氮誘導的驚厥發(fā)作，且在電休克誘導的驚厥模型中，苯妥因聯(lián)合COX-2抑制劑能增強其抗驚厥作用。目前有關COX-2在癲癇是否參與了顳葉癲癇海馬環(huán)路內(nèi)突觸重建，從而促進了顳葉癲癇的形成與發(fā)展尚不清楚，且其抑制劑抗驚厥的作用機制國內(nèi)外均未見有進一步深入的研究。本研究旨在研

4、究COX-2在癇性發(fā)作活化后的表達特點，看COX-2抑制劑是否能通過抑制COX-2的活性來糾正癇性活動引起腦內(nèi)微環(huán)境改變所致的海馬異常突觸重構，從而減少慢性期自發(fā)性反復性癇性發(fā)作(SRS)的發(fā)生，研究其在癇性發(fā)作后突觸重構密切相關的異常神經(jīng)發(fā)生及膠質(zhì)細胞活化和增生等事件中的作用及發(fā)揮作用的細胞信號轉(zhuǎn)導途徑。COX-2抑制劑對癇性發(fā)作后海馬結構和功能改變這種長時程事件的影響是通過對神經(jīng)元突觸電活動的影響而實現(xiàn)的，可能和影響神經(jīng)遞質(zhì)釋放及改

5、變離子通道通透性等有關。而Na+離子通道是許多抗癲癇藥物的治療靶點。我們通過建立體外海馬腦組織切片癇樣放電模型，向腦片灌流液中加入COX-2抑制劑，觀察其對海馬CA1椎體神經(jīng)元膜興奮特性、鈉離子通道及突觸活動的影響，從多角度、多層次來研究COX-2及其抑制劑在幼鼠癇性發(fā)作中的作用及其機制，看能否提供新的控制癲癇發(fā)作的治療策略和預防靶點。 方法： 1.體內(nèi)部分實驗： 模型制作：隨機將120只體重為50～60g的3周

6、齡健康Wistar幼鼠分為匹魯卡品致癇組(EP-Only組)(n=45)和塞萊昔布干預致癇組(EP-Celecoxib)(n=45)和生理鹽水正常對照組(NS組)(n=30)3組。匹魯卡品癲癇模型的建立：腹腔注射10％匹魯卡品350 mg/kg，若注射匹魯卡品后30min無驚厥發(fā)作，再按每次10mg/kg追加匹魯卡品，若驚厥發(fā)作持續(xù)30min(定為癲癇持續(xù)狀態(tài)的標準)仍未停止，則給予10％水合氯醛400mg/kg腹腔注射，及時終止發(fā)作。

7、EP-Celecoxib組大鼠在注射東莨宕堿前45min預先通過胃管灌入20mg/kg.d的塞萊昔布，腹腔注射完匹魯卡品后每天均按此劑量灌胃，直至動物被處死。隨機在EP-only及EP-Celeeoxib組各取10只匹魯卡品成功誘導急性發(fā)作幼鼠進行腹腔注射BrdU，劑量100mg/kg，從急性發(fā)作當天開始，隔天注射一次，直到發(fā)作后第14天。 (1)動物行為學觀察：根據(jù)Racine分級評價癇性發(fā)作行為。觀察急性期癲癇幼鼠癇性發(fā)作行

8、為在各組的差異，監(jiān)測慢性期(急性發(fā)作后28～42天)自發(fā)性反復性發(fā)作(SRS)的發(fā)生率及發(fā)作強度在各組的差異。 (2)形態(tài)學檢測：各試驗組分別在急性發(fā)作后第14天，28天處死大鼠制備組織切片。①Nissl染色：檢測海馬神經(jīng)元損傷及丟失情況；②免疫組織化學方法：檢測指標有COX-2、C-fos及p-ERK1/2陽性細胞在各組的表達變化趨勢，OX-42標記少突膠質(zhì)細胞的活化，比較小膠質(zhì)細胞的活化在各組的差異；BrdU標記增殖的新生細

9、胞，NeuN為特異性神經(jīng)元標志，GFAP為星型膠質(zhì)細胞特異性標志，BrdU+NeuN熒光免疫雙標標記癇性發(fā)作后新生神經(jīng)元，BrdU+GFAP免疫雙標標記增生的星型膠質(zhì)細胞，觀察神經(jīng)前體細胞的增殖及分化在各組的差異； (3)western blot方法：檢測COX-2、C-fos、ERK1、ERK2及磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白水平在癇性發(fā)作后1h、1d、4d、7d、14d、28d各時點的表達及變化趨勢，比較在匹魯卡品誘導S

10、E后的靜止期其表達水平在各組的表達是否有差異，探討COX-2及其抑制劑發(fā)揮作用的細胞信號轉(zhuǎn)導途徑。 2.體外試驗部分： 離體海馬腦片癇樣放電模型的建立：生后14天齡SD大鼠，快速斷頭取腦后用振動切片機切成400μm海馬組織腦切片，用電刺激誘發(fā)CA1區(qū)錐體神經(jīng)元記錄場電位，以群峰電位(PS)個數(shù)和幅度的變化來評價腦片放電的變化，灌流不同濃度青霉素，觀察到藥物作用約3min后PS個數(shù)增多和幅度增加，有明顯的癲癇樣放電，建立離

11、體海馬腦片癇樣放電模型，從以下幾方面來觀察COX-2抑制劑NS-398對癇性放電后海馬錐體神經(jīng)元電生理特性的影響： (1)COX-2抑制劑NS-398對青霉素致癇腦片CA1場電位的影響：腦片灌流液中灌流不同濃度NS-398，觀察對PS個數(shù)和幅度的影響； (2)腦片全細胞記錄技術研究NS-398對青霉素致癇幼鼠海馬腦片CA1區(qū)錐體神經(jīng)膜興奮特性的影響，分析對動作電位幅度、頻率、潛伏期和時程的影響； (3)通過給予不

12、同階躍模式的電壓刺激，觀察NS-398對電壓依賴性鈉離子通的影響，分別研究對其激活曲線和失活曲線的影響； (4)全細胞記錄Gap-free模式下，觀察NS-398對海馬CA1錐體神經(jīng)元遞質(zhì)釋放和突觸活動的影響，分別記錄自發(fā)性興奮性突觸后電流(sEPSCs)和自發(fā)性抑制性突觸后電流(sIPSCs)，觀察NS-398對其幅度和頻率的影響。 結論： 1.COX-2在癇性發(fā)作后被迅速誘導表達，COX-2抑制劑能抑制癇性發(fā)

13、作及發(fā)作后COX-2的活化； 2.COX-2抑制劑能減少癇性發(fā)作后海馬神經(jīng)元的死亡，抑制小膠質(zhì)細胞的活化，抑制癇性發(fā)作激活的異常神經(jīng)發(fā)生和星型膠質(zhì)細胞增生，糾正癇性發(fā)作后海馬異?？伤苄缘陌l(fā)生，從而減少慢性期SRS的發(fā)生； 3.COX-2抑制劑逆轉(zhuǎn)海馬異常可塑性的發(fā)生是通過抑制癇性發(fā)作激活的MAPK/ERK信號轉(zhuǎn)導途徑及其下游信號分子C-fos而發(fā)揮效應； 4.COX-2抑制劑能延長海馬錐體神經(jīng)元鈉離子通道失活時間