攜帶tPA真核表達載體PLGA納米粒-超聲微泡復合體的構建及體外實驗研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分:pIRES-tPA-Dsred Express-2真核表達質粒的構建和體外表達
　　目的:構建攜帶有組織型纖溶酶原激活因子目的片段的真核表達載體pIRES-tPA-Dsred Express2。驗證該質粒轉染人臍靜脈內(nèi)皮細胞系 EA.hy926是否高表達組織型纖溶酶原激活因子,其產(chǎn)物蛋白是否具有生物學活性。
　　方法:勾取 tPA基因的CDS序列,通過基因工程技術將其插入

2、 pIRES-Dsred Express2質粒,構建攜帶有人組織型纖溶酶原激活因子目的片段的真核表達載體pIRES-tPA-Dsred Express2。將構建成功的真核表達載體 pIRES-tPA-Dsred Express2用脂質體轉染試劑 Lipofectamine? LTX轉染人臍靜脈內(nèi)皮細胞系 EA.hy926。應用逆轉錄實時熒光定量 PCR檢測轉染后48小時,細胞內(nèi)目的蛋白 mRNA含量;Western Blot檢測轉染后相

3、關蛋白表達情況;應用ELISA技術,檢測細胞培養(yǎng)上清中tPA含量;應用酶促反應檢測細胞培養(yǎng)上清中人組織型纖溶酶原激活因子活性。觀察轉染 pIRES-tPA-Dsred Express2載體后人臍靜脈內(nèi)皮細胞系 EA.hy926對于人組織型纖溶酶原激活因子及其相關蛋白分泌及其活性隨時間的變化關系。
　　結果:通過將 tPA目的基因片段插入 pIRES-Dsred Express2質粒,成功構建了真核表達載體 pIRES-tPA-Ds

4、red Express2。體外轉染人臍靜脈內(nèi)皮細胞系EA.hy926后48小時可以觀察到細胞可激發(fā)紅色熒光,轉染效率為(20.7±4.2)％。逆轉錄實時定量 PCR檢測顯示 pIRES-tPA-Dsred Express2質粒組其 tPA,Dsred的mRNA相對含量分別為769.21±35.11及1164.26±82.85,顯著高于對照組。Western Blot檢測顯示,目的蛋白 tPA及紅色熒光蛋白 Dsred含量顯著增高。細胞上

5、清人組織型纖溶酶原激活因子含量及人組織型纖溶酶原激活因子活性檢測顯示pIRES-tPA-Dsred Express2質粒組(4.73±0.02) ng/hour·(105cells),活性為(9.48±0.12)IU/hour·(105cells),顯著高于對照組。轉染 pIRES-tPA-Dsred Express2后內(nèi)皮細胞上清中的人組織型纖溶酶原激活因子濃度及活性在24小時為最高,而后呈現(xiàn)下降趨勢。人組織型纖溶酶原激活因子活性變化

6、受纖溶酶原激活物抑制劑-1影響與其濃度變化方式不同。
　　結論:成功構建了攜帶有人組織型纖溶酶原激活因子的真核表達載體pIRES-tPA-Dsred Express2。體外轉染驗證其可正確指導合成及分泌組織型纖溶酶原激活因子,表現(xiàn)出顯著纖溶活性,為后續(xù)實驗奠定了實驗基礎。
　　第二部分:超聲微泡介導 pIRES-tPA-Dsred Express2-脂質體復合體體外轉染及表達
　　目的:通過超聲微泡介導的基因治療技術將

7、攜帶有組織型纖溶酶原激活因子基因的質粒 pIRES-tPA-DsRed-Express2-脂質體復合體體外轉染內(nèi)皮細胞,使內(nèi)皮細胞高表達組織型纖溶酶原激活因子,觀察超聲介導的基因治療技術對于內(nèi)皮細胞質粒轉染的效果。
　　方法:薄膜水化制備全氟丙烷超聲微泡。使用全氟丙烷微泡介導pIRES-tPA-DsRed-Express2-脂質體復合體轉染人臍靜脈內(nèi)皮細胞系 EA.hy926細胞。通過熒光計數(shù),計算細胞轉染效率。應用逆轉錄實時熒光

8、定量 PCR檢測轉染后48小時,細胞的目的蛋白 mRNA含量;應用ELISA技術,檢測上清中tPA含量及活性。
　　結果:制備的全氟丙烷超聲微泡平均大小為(3.5±1.4)μm。微泡濃度為(3.3±1.2)×108/ml。zeta電位為(-2.2±1.5)mV。制備后的12小時內(nèi)性質穩(wěn)定。轉染后48小時,超聲微泡介導組(UM+LTX)轉染效率為(27.3±3.6)％, Lipofectamine? LTX轉染組(LTX)轉染效率為

9、(20.6±2.0)％。逆轉錄實時熒光定量 PCR檢測顯示 UM+LTX組及LTX組,目的蛋白 tPA的mRNA的相對含量分別為(953.15±92.77)和(721.32±68.31),具有顯著性差異。熒光蛋白 Dsred的mRNA相對含量分別為(1191.22±109.31)和(1092.15±102.71)。UM+LTX組其細胞上清中的tPA含量及tPA活性均較 LTX顯著升高。
　　結論:成功制備了含有全氟丙烷的超聲微泡。

10、通過超聲微泡介導質粒-脂質體復合體轉染內(nèi)皮細胞 EA.hy926,進一步提高了質粒-脂質體復合體轉染內(nèi)皮細胞的轉染效率,從而提高目的蛋白組織型纖溶酶原激活因子的表達分泌量,提高了纖溶活性。
　　第三部分:攜帶可表達 tPA真核表達載體 PLGA納米粒-超聲微泡復合體的構建及體外吞噬實驗
　　目的:構建攜帶有可表達組織型纖維溶酶激活因子質粒的PLGA納米粒-超聲微泡復合體。檢測其理化性質,體外緩釋方式,細胞毒效應及其在超聲介導

11、下對于細胞攝取納米粒的影響。
　　方法:應用雙次乳化法制備攜帶有 pIRES-tPA-DsRed Express2質粒的PLGA納米粒;應用薄膜水化超聲法制備陽離子超聲微泡;兩者通過靜電吸附的方式形成 PLGA納米粒-超聲微泡復合體。檢測 PLGA納米粒的載藥量,PLGA納米粒-超聲微泡復合體質粒載量;檢測納米粒及納米粒-超聲微泡復合體細胞毒性;檢測PLGA納米粒及PLGA納米粒-超聲微泡復合體體外緩釋質粒的方式;檢測其在超聲輻照

12、介導的微泡解構時介導體外細胞吞噬納米粒的能力。
　　結果:自制的納米粒其粒徑為(217.2±2.2)nm,zeta電位為(-15.24±0.83) mV。微泡平均大小為(3.2±1.5)μm,Zeta電位為(13.66±2.05)mV。微泡濃度為(4.3±1.1)×108/ml。納米粒-超聲微泡復合體其平均大小為(4.6±1.7)μm。zeta電位為(2.23±1.45)mV。濃度為(3.0±1.3)×108/ml。1mgPLGA

13、納米粒載有質粒(42.3±2.1)μg。1ml納米粒-超聲微泡復合體中帶有質粒(20.5±2.7)μg。納米粒及納米粒-超聲微泡復合體均表現(xiàn)為在起始段短時內(nèi)質?？焖籴尫?后呈現(xiàn)穩(wěn)定釋放的趨勢。到達第7天時,釋放量達到其總量的(57±3)％。納米粒及納米粒-超聲微泡復合體均未見明顯細胞毒性效應,僅最高濃度組見輕度的細胞活性減少。PLGA納米粒組及PLGA納米粒-超聲微泡復合體組均可見大量的納米粒被吞噬。PLGA納米粒-超聲微泡復合體組在超