胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為大腦皮質(zhì)谷氨酸能神經(jīng)元的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:谷氨酸能神經(jīng)元作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的興奮性神經(jīng)元，調(diào)節(jié)著釋放進(jìn)入突觸間隙谷氨酸遞質(zhì)的量，參與了幾乎所有腦的功能。它的異常和丟失會(huì)導(dǎo)致興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的異常，從而誘發(fā)多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，諸如阿爾茲海默病(Alzheimer's disease，AD)、帕金森病(Parkinson's disease，PD)、精神分裂癥、抑郁癥、癲癇、耳聾發(fā)病等。而胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells，ESCs)以其可體外無(wú)限增

2、殖和全能性等生物學(xué)特性，有望為神經(jīng)系統(tǒng)疾病細(xì)胞替代性治療提供細(xì)胞來(lái)源。以往的研究都集中于胚胎干細(xì)胞經(jīng)外部因素的誘導(dǎo)而轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元細(xì)胞，不僅方法過(guò)于復(fù)雜，而且誘導(dǎo)效率也較低，因此本論文擬開展研究一種新的胚胎干細(xì)胞神經(jīng)分化的誘導(dǎo)方法。
　　方法:1.分離BALB/c小鼠囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Inner cell mass，ICM)，放置于飼養(yǎng)層細(xì)胞上生長(zhǎng)，制備小鼠胚胎干細(xì)胞(mouse Embryonic stem cells，mESCs)，

3、培養(yǎng)傳代并鑒定后，凍存?zhèn)溆谩?.利用優(yōu)化的無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法誘導(dǎo)mESCs向端腦前體細(xì)胞選擇分化，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Bf1+和Emx1+端腦皮質(zhì)前體細(xì)胞的比例。3.PCR擴(kuò)增不同分化階段細(xì)胞標(biāo)志基因胚胎干細(xì)胞關(guān)鍵蛋白(0ct3/4)、巢蛋白(Nestin)、β-微管蛋白Ⅲ(Tuj1)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的cDNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其含量。4.環(huán)巴胺誘導(dǎo)端腦前體細(xì)胞選擇分化為VGLUT1+谷氨酸能神經(jīng)元。5.免疫熒光染色優(yōu)化法誘

4、導(dǎo)所得細(xì)胞的谷氨酸能神經(jīng)元標(biāo)記Tuj1+和VGlUT1+。6.膜片鉗記錄檢測(cè)體內(nèi)、外VGLUT1+神經(jīng)元電生理特性。
　　結(jié)果:1）該法可使mESCs自主發(fā)生神經(jīng)細(xì)胞分化，主要依賴細(xì)胞的內(nèi)部機(jī)制和弱的內(nèi)源性細(xì)胞外信號(hào)。2）此種誘導(dǎo)技術(shù)能使mESCs高效分化為Bf1+端腦前體細(xì)胞，達(dá)總細(xì)胞量的70％，其中89％細(xì)胞表達(dá)皮質(zhì)標(biāo)記物Emx1。3）該法能使mESCs按照一個(gè)先神經(jīng)元-后膠質(zhì)細(xì)胞的順序有效分化，與體內(nèi)胚胎神經(jīng)組織發(fā)育先后順序