肝臟F蛋白的表達(dá)及單克隆抗體的制備.pdf

1、肝臟疾病嚴(yán)重影響人類健康，并對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展產(chǎn)生巨大影響。肝癌是世界上死亡率最高的惡性腫瘤之一，病毒性肝炎、肝纖維化、肝硬化等都是肝癌主要的致病原。因此肝病的診斷就成為醫(yī)學(xué)診斷學(xué)的重要組成部分。人類肝臟F蛋白是一種新型的尚未應(yīng)用于臨床的直接反映肝損傷程度的生物學(xué)標(biāo)志之一。從80年代開始，人們開始研究血清F蛋白含量與肝損傷程度的關(guān)系，獲得了一些臨床數(shù)據(jù)。肝細(xì)胞中的F蛋白濃度與血清F蛋白的濃度之間存在的巨大差異以及F蛋白的嚴(yán)格的組織特異性，使

2、其成為一種非常有希望的反映肝細(xì)胞損傷程度的靈敏和特異的指標(biāo)。目前，肝臟特異性F蛋白的研究與臨床應(yīng)用受到越來越多的關(guān)注。 本文在前人研究的基礎(chǔ)上，將F蛋白的表達(dá)質(zhì)粒pET15b-F轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21(DE3)pLysS中，用IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)，表達(dá)后通過親和層析柱(Ni2+-chargedIDAHis-bindcolumn)純化，用十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳與免疫印跡(Westernblot)對(duì)其進(jìn)行檢測。并以此蛋白為

3、抗原免疫BALB-C小鼠以獲得免疫的脾細(xì)胞，用間接ELISA法測定其血清抗體的效價(jià)，選取抗體效價(jià)高的小鼠取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，制備單克隆抗體。 人F蛋白的表達(dá)菌株BL21(DE3)pLysS表達(dá)后的全菌蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，目的條帶分子量大小約為43kD，與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)一致。Western-blot顯示純化后的F蛋白與豚鼠抗人提純F蛋白多克隆抗血清反應(yīng)為陽性，說明我們經(jīng)基因工程方法得到的純化的F蛋白具有免疫活性。免疫

4、BALB-C小鼠后，用ELISA法測定血清其抗體滴度高達(dá)1:72000，可用于單抗的制備；細(xì)胞融合后培養(yǎng)上清有15孔抗體陽性，抗體滴度最高為1:25600，Western-blot顯示制備的抗體與基因工程表達(dá)的人肝臟特異性F蛋白發(fā)生了反應(yīng)，表明我們制備的抗體具有免疫特異性，可用于后續(xù)的單克隆抗體的大量制備和提純以及免疫試劑的開發(fā)。 肝臟特異性F蛋白是反映肝損傷的一種靈敏、有效而又穩(wěn)定的指標(biāo)，同時(shí)F蛋白在肝病早期診斷與治療、藥物的

5、篩選與療效觀察、治愈狀況、肝損傷程度的判斷等方面以及法醫(yī)學(xué)方面、免疫耐受肝移植抗排斥方面的研究都具有重要的應(yīng)用價(jià)值。用化學(xué)提純的方法很難得到大量F蛋白，這就阻礙了其他研究的進(jìn)行。因此，本文采用基因工程方法得到人肝臟F蛋白的表達(dá)克隆，并誘導(dǎo)表達(dá)人肝臟F蛋白，解決了其來源問題。同時(shí)以此基因工程蛋白為抗原初步制備單克隆抗體，并通過免疫印跡法證實(shí)了此抗體的特異性，為下一步的免疫試劑最適條件的摸索、免疫耐受及其免疫學(xué)特性等研究打下基礎(chǔ)，為臨床肝病