AT2R基因轉染對經(jīng)球囊損傷的大鼠頸動脈體外培養(yǎng)后新生內(nèi)膜增生影響的實驗研究.pdf

1、背景和目的：經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(PCI)廣泛應用于缺血性心臟病，但術后再狹窄(RS)仍是影響其遠期療效的最主要因素。目前PCI術后RS的機制尚不十分清楚，普遍認為是多因素、多種機制共同參與的過程。其中動脈血管的彈性回縮、血栓形成、血管壁重塑以及血管壁中層VSMC的過度增殖和遷移被認為是促使PCI術后RS發(fā)展的主要因素。腎素血管緊張素系統(tǒng)參與了球囊損傷后再狹窄的形成。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)介導的生物學作用是重要的因素之一，其作用是通過

2、VSMC細胞膜的受體(ATR)介導完成的。ATR有四種亞型，以AT1R和AT2R為主，存在于動物和人類的組織中。國內(nèi)外大量研究資料表明：AngⅡ的促進新生內(nèi)膜形成的作用主要是AT1R介導的，AT2R則與AT1R的作用相拮抗。 本實驗室已有研究結果證實：(1)VSMC轉染表達AT2R后，AT2R表達可明顯抑制VSMC的增殖與遷移。AngⅡ刺激可增強AT2R所產(chǎn)生的抑制VSMC增殖和遷移的作用，但其增強作用對AngⅡ無顯著濃度依賴性

3、。(2)VSMC轉染表達AT2R后，AT2R表達可明顯促進VSMC發(fā)生凋亡，AT2R的致凋亡作用與AngⅡ無明顯關系。AT2R所介導的抑制VSMC增殖、遷移并促進其凋亡作用有利于減少血管損傷后新生內(nèi)膜形成。 但以前的研究均局限于細胞水平。在此基礎上，進一步了解AT2R基因轉染經(jīng)球囊損傷的大鼠頸動脈并觀察體外培養(yǎng)后對新生內(nèi)膜增生的影響，有助于探討AT2R基因轉染在RS防治中的可行性及潛在意義，為在體實驗提供實驗依據(jù)。 方法

4、：(1)采用先進的腺病毒AdEasy系統(tǒng)，應用細菌內(nèi)同源重組方法構建重組腺病毒，將穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMV/AT2R酶切線性化再轉化含有超螺旋腺病毒核心基因組的AdEasier-1細菌，卡那霉素抗性選擇轉化重組子重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-1/AT2R，在脂質(zhì)體介導下轉染293細胞，從而獲得含AT2R基因的腺病毒載體pAdCMV/AT2R。 (2)采用含30％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液以及使用95％O2和5％CO2的氣體環(huán)

5、境進行動脈血管的器官培養(yǎng)。利用光鏡、電鏡、共聚焦顯微鏡相結合綜合評定動脈血管器官培養(yǎng)14天時的生存狀況。 (3)將構建的AT2R重組腺病毒轉染經(jīng)球囊損傷的大鼠頸動脈，并進行體外培養(yǎng)。 (4)應用RT-PCR、免疫組化、蛋白免疫印跡檢測AT2R的表達。 (5)TUNEL法檢測血管組織中凋亡細胞的變化情況。 結果：(1)成功構建了重組腺病毒載體pAdCMV/AT2R。構建的pAdCMV/AT2R用293細胞大

6、量擴增，收集并純化，獲得的病毒滴度約1.5×1012pfu/ml。 (2)采用含30％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液以及使用95％O2和5％CO2的氣體環(huán)境進行大鼠頸動脈體外培養(yǎng)14天，經(jīng)光鏡、電鏡、共聚焦顯微鏡相結合綜合評價，動脈血管環(huán)培養(yǎng)14仍然存活。 (3)經(jīng)球囊損傷的大鼠經(jīng)動脈在體外培養(yǎng)14天，有新生內(nèi)膜增生。 (4)重組腺病毒轉染經(jīng)球囊損傷的大鼠頸動脈后，體外培養(yǎng)3天在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，表明轉染成功

7、。 (5)損傷的大鼠頸動脈體外培養(yǎng)1周，三組動脈內(nèi)膜增生無顯著差異；培養(yǎng)2周，與未轉染組和PAd-GFP組相比，PAdCMV/AT2R組的內(nèi)膜/中膜面積比分別降低了約20％、17％，表明腺病毒介導的AT2R基因轉染可明顯抑制大鼠頸動脈內(nèi)皮損傷后的新生內(nèi)膜增生。 (6)RT-PCR檢測結果表明，在轉染3天后，在轉染組血管檢測到AT2RmRNA的表達而對照病毒組及未轉染組未檢測到AT2RmRNA。AT2R免疫印跡結果也進一步

8、證實，在轉染3天后，PAdCMV/AT2R組開始有AT2R蛋白表達，7天、14天后表達水平持續(xù)升高。PAd-GFP組和未轉染組均無AT2R的蛋白表達。免疫組織化學在各時相點PAdCMV/AT2R組均有AT2R陽性細胞表達，而未轉染組和PAd-GFP組未見AT2R陽性細胞表達。 (7)體外培養(yǎng)的血管有少量的凋亡現(xiàn)象，但轉染AT2R后，血管的新生內(nèi)膜及中膜的細胞凋亡顯著增多。 結論：(1)本研究建立了體外動脈器官培養(yǎng)的模型，