補腎中藥血清對體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞作用機(jī)理的研究.pdf

1、目的：1、改良成人成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，以滿足在細(xì)胞學(xué)水平進(jìn)行骨代謝性疾病研究的需要。2、研究補腎中藥對成骨細(xì)胞的作用機(jī)制。 方法：1、成骨細(xì)胞分離及鑒定：取成人無菌骨碎片，用組織塊貼壁法和酶消化法相結(jié)合，得到成骨細(xì)胞；用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長及形態(tài)特征，分別采用堿性磷酸酶細(xì)胞化學(xué)染色、成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)檢測、骨鈣素免疫組化及合成Ⅰ型膠原的免疫熒光分析等進(jìn)行檢測。2、實驗分組及檢測指標(biāo)：(1)實驗分組：雄性SD大鼠13只，隨機(jī)分為

2、空白組1只，龍牡壯骨沖劑組3只，補腎中藥高、中、低濃度組各3只，分別用龍牡壯骨沖劑或補腎中藥液2次/天，連續(xù)3天灌胃，除空白組外，每組3只分別于末次給藥后45min、60min、75min，經(jīng)腹主動脈采血制備含藥血清，用于培養(yǎng)成骨細(xì)胞。(2)檢測指標(biāo)：采用培養(yǎng)上清骨型堿性磷酸酶測定、成骨細(xì)胞上清液骨鈣素含量檢測、3H-TdR摻入細(xì)胞實驗、流式細(xì)胞儀檢測、RT-PCR檢測Ⅰ型膠原基因表達(dá)等方法觀察含藥血清對體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的影響。

3、 結(jié)果：1、細(xì)胞堿性磷酸酶染色陽性，隨培養(yǎng)時間的延長，鈣結(jié)節(jié)逐漸增多，經(jīng)Von-Kossa染色，鏡下觀察為黑色結(jié)節(jié)。骨鈣素免疫組化染色成骨細(xì)胞被染成黃色。Ⅰ型膠原免疫熒光染色，靜止期成骨細(xì)胞被輕度染成藍(lán)色熒光；隨著細(xì)胞有絲分裂的進(jìn)行，成骨細(xì)胞熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。2、(1)龍牡各組能顯著升高培養(yǎng)上清堿性磷酸酶的活性(P＜0.01)。喂藥后60min血清組堿性磷酸酶的活性與喂藥后45min血清組有顯著差異(P＜0.05)，而與喂藥后75min血清

4、組比較，無顯著差異(P＞0.05)。補腎中藥各組能顯著提高培養(yǎng)上清堿性磷酸酶的活性，與龍牡各組相比較，喂藥后60min血清組達(dá)到藥效頂點。在各時間點，隨著用藥量的增加，堿性磷酸酶的活性逐漸升高，中等濃度組與低濃度組比較，有顯著差異(P＜0.05)，而高濃度組與中等濃度組之間無顯著差異(P＞0.05)。(2)龍牡各組能夠顯著地使培養(yǎng)上清骨鈣素的活性升高(P＜0.01)。喂藥后60min血清組培養(yǎng)上清骨鈣素的活性與喂藥后45min血清組有顯

5、著差異(P＜0.05)，而與喂藥后75min血清組比較，無顯著差異(P＞0.05)。補腎中藥各組能夠顯著地提高培養(yǎng)上清骨鈣素的活性，在喂藥后60min血清組達(dá)到藥效頂點。在各時間點，隨著用藥量的增加，骨鈣素的活性逐漸升高，中等濃度組與低濃度組比較，有顯著差異(P＜0.05)，而高濃度組與中等濃度組之間無顯著差異(P＞0.05)。(3)經(jīng)不同濃度補腎中藥處理45min的成骨細(xì)胞，其細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量明顯高于對照組，具有顯著性差異(P＜0.

6、01)。龍牡組和補腎中藥各組Ca2+陽性細(xì)胞百分比以及細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光值無顯著差異，表明以上各組血清能夠顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞對Ca2+的吸收。(4)加入補腎中藥后，成骨細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+濃度均有明顯瞬時升高。成骨細(xì)胞S期和G2期比例增大，DNA合成增加，細(xì)胞增殖活動旺盛，而對照組大部分細(xì)胞都休止在G1期，S期和G2期細(xì)胞所占比例減少，表明DNA合成減少，細(xì)胞增殖基本處于靜止?fàn)顟B(tài)。(5)龍牡和補腎中藥能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞對Ⅰ型膠原基因的表達(dá)。對照

7、組能夠表達(dá)少量Ⅰ型膠原，補腎中藥低濃度組使Ⅰ型膠原的表達(dá)量有所增加，而補腎中藥中濃度組能夠顯著增強(qiáng)Ⅰ型膠原基因的表達(dá)，與龍牡組無明顯差異。 結(jié)論：1、采用組織塊貼壁法和胰酶消化法相結(jié)合獲得的成骨細(xì)胞純度高、數(shù)量較多，且培養(yǎng)時間明顯縮短。2、(1)補腎中藥能夠顯著增強(qiáng)成骨細(xì)胞合成堿性磷酸酶，加速鈣化速度。(2)成骨細(xì)胞在補腎中藥的作用下，合成并分泌大量骨鈣素，參與成骨細(xì)胞形成新骨的過程，被固定在新生骨質(zhì)中，并且反映成骨細(xì)胞的合成功