高糖經(jīng)內(nèi)質網(wǎng)應激誘導肝細胞凋亡及其分子機制.pdf

1、目的:探討高糖對肝癌細胞株HepG2細胞內(nèi)質網(wǎng)應激、細胞凋亡的影響及其分子機制，并通過高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素注射構建2型糖尿病(T2DM)模型大鼠探討褪黑素和西格列汀對T2DM大鼠肝臟的保護作用。
　　方法:高糖培養(yǎng)HepG2細胞作為細胞模型：Hoechst33258染色檢測細胞凋亡情況，caspase-3活性檢測測定促凋亡蛋白caspase-3的活性，western blot檢測凋亡相關蛋白procaspase-9、內(nèi)質網(wǎng)應激(

2、endoplasmic reticulum stress,ERS)相關蛋白(GRP78、CHOP、PERK)、氧化應激相關蛋白p47phox、MAPKs及ASK1的表達情況。HepG2細胞給予抗氧化劑α-硫辛酸、JNK和p38抑制劑(分別為SP600125、SB203580)2h后聯(lián)合40mM葡萄糖刺激，Hoechst33258染色、western blot、細胞免疫熒光分別檢測細胞凋亡、凋亡及ERS相關蛋白(Bcl-2、Grim19、

3、GRP78)、CHOP的表達和定位情況。T2DM大鼠模型：37只SPF級雄性SD大鼠隨機分配到正常對照(NC)、高脂對照(HF)、2型糖尿病(T2DM)、胰島素(INS)、褪黑素(MEL)和西格列汀(SIT)組。高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ(27mg/kg)注射建立T2DM大鼠模型。成功建模后，INS組皮下注射胰島素(4U/(kg·d))，MEL、SIT組大鼠分別給予褪黑素(10mg/(kg·d))、西格列汀(10mg/(kg·d))灌胃。

4、12周后，取大鼠血及肝臟組織，測定血糖、血脂、胰島素水平，HE染色觀察肝臟形態(tài)結構，免疫組化(IHC)及western blot分析凋亡、ERS相關蛋白、褪黑素受體的表達變化。
　　結果:高糖誘導的HepG2細胞：高糖刺激48h后，HepG2細胞凋亡比例、caspase-3活性及procaspase-9裂解均隨葡萄糖濃度升高而增加；ERS相關蛋白GRP78表達減少而CHOP、PERK表達均上升，p47phox表達亦上調(diào)；ASK1表

5、達、JNK和p38磷酸化水平均增加；α-硫辛酸、SP600125和SB203580均可減少高糖誘導的HepG2細胞凋亡、增加抗凋亡蛋白Bcl-2而抑制促凋亡蛋白Grim19的表達、抑制CHOP表達和核定位。T2DM大鼠模型：成功構建T2DM大鼠模型，T2DM大鼠空腹血糖(FBG)為(16.91±1.79)mmol/L，胰島素敏感性指數(shù)(lnISI)為-6.60±0.21較NC組明顯下降，提示存在胰島素抵抗(insulin resista

6、nce,IR)。HE染色顯示HF、T2DM組大鼠肝臟組織均發(fā)生了病理改變，T2DM組改變更為嚴重。IHC顯示T2DM組大鼠肝臟活性caspase-3表達明顯增加且轉移到胞核。Western blot顯示HF組和T2DM組大鼠肝組織CHOP表達上升而GRP78表達下降，HF組與T2DM組這兩個ERS相關蛋白表達水平亦存在顯著差別；但ATF-6α在各組大鼠肝臟表達未見明顯差異?？寡趸瘎㎝el和DPP-4抑制劑SIT雖然不能明顯降低T2DM大

7、鼠血漿TG、Tch、LDL-c水平，Mel也不能降低FBG，但它們能顯著減少FINS、增加胰島素敏感性，且對T2DM大鼠肝臟存在明顯的保護作用，改善T2DM大鼠肝臟的病理改變，下調(diào)CHOP和caspase-3并上調(diào)GRP78的表達。
　　結論:高濃度葡萄糖可誘導肝癌細胞株HepG2細胞凋亡，其作用機制可能是經(jīng)由ERS和氧化應激介導的ASK1-p38/JNK通路活化，調(diào)控下游凋亡相關基因的表達；而Mel和SIT通過改善T2DM大鼠I