角膜不同保存方法與術后免疫排斥反應相關性的實驗研究.pdf

1、目的： 角膜病是當今世界主要的致盲性眼病之一，角膜移植手術是治療角膜病患者脫盲最有效的方法。眼庫及角膜保存技術是開展角膜移植的物質基礎。但是目前角膜移植材料來源短缺及各地區(qū)材料分布不均勻，臨床上往往不能滿足角膜移植患者量多和應付急診手術的要求，故對有限移植材料的保存日益受到人們的重視。所以，建立有效的眼庫和深入研究角膜保存方法，延長角膜的生命活力，充分利用有限的角膜材料，隨時為臨床角膜移植提供優(yōu)質供體材料是一個重要課題?；诙唐?/p>

2、保存方法對角膜材料保存時間的限制，如果能做到中長期活性材料的保存，將為角膜移植的開展起到關鍵的作用。角膜移植手術是治療角膜病致盲的重要手段，術后角膜排斥反應是角膜移植手術失敗的主要原因。角膜移植排斥反應是一個多因素參與，極其復雜和高度調(diào)節(jié)的過程。有關角膜移植的排斥反應的發(fā)生機制在許多環(huán)節(jié)上尚不清楚。如何將角膜移植的排斥反應降到最低限度已經(jīng)成為國內(nèi)外許多眼科學者的主要研究課題。本試驗通過探索簡易安全的中長期保存供體角膜的方法，采用大鼠角膜

3、行中期保存液和深低溫冷凍長期保存，來評價不同保存方法保存后角膜內(nèi)皮細胞活性，研究其使用的可靠性，為臨床能夠提供更為滿意優(yōu)質的活性角膜供體材料及應用中長期保存材料行穿透性角膜移植奠定基礎；旨在對不同方法保存的角膜行穿透性角膜移植后的觀察，探討角膜保存時間與術后排斥反應的關系，通過病理和免疫學方法定性和定量測定細胞因子和粘附分子(TNF-a和ICAM-1)的含量變化，并分析其原因，為提高角膜移植的成功率減少排斥反應的發(fā)生探索新的途徑。

4、 方法： 1、建立簡易中期保存液和微機監(jiān)控程序降溫的深低溫保存法。將30只雌性成年健康清潔級Wistar鼠眼隨機分為3組，應用不同保存方法保存大鼠角膜。分別為濕房保存組(Ⅰ組)、中期保存液保存組(Ⅱ組)和深低溫保存組(Ⅲ組)。采用臺盼藍．茜素紅染色對不同保存方法的角膜內(nèi)皮細胞進行評價。判定3種不同保存方法的角膜內(nèi)皮細胞的活性狀態(tài)。 2、建立大鼠穿透性角膜移植排斥反應動物模型。分別使用不同保存方法的Wistar鼠眼(實驗

5、一Ⅰ組)和角膜片(實驗一Ⅱ組、Ⅲ組)作為供體，成年雌性健康清潔級SD大鼠作為受體，隨機分3組。觀察各組角膜移植術后免疫排斥反應指數(shù)(RI)、植片存活時間(MST)。標本行蘇木素．伊紅(HE)染色及免疫組織化學染色，觀察植片的免疫排斥反應程度及炎癥程度。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗，檢測各組大鼠角膜移植術后10天時房水、血清中腫瘤壞死因子-a(TNF-a)的含量變化。 結果： 1、經(jīng)不同方法保存后的各組大鼠角膜內(nèi)皮細胞密度及活性率

6、相似。使用中期保存液保存組和深低溫保存組后復溫的角膜植片內(nèi)皮細胞密度和活性率與濕房保存組比較差異無顯著性(濕房組細胞密度2729.5±158.0個/mm<'2>，活性率ESR％為88.9％±3.5％；中期保存液保存組分別為2646.84±217.2個/mm<'2>和86.9％±2.7％；深低溫保存組分別為2706.24±184個/mm<'2>和87.3％±3.3％，P>0.05)。中長期保存角膜只要關鍵步驟合理，角膜內(nèi)皮細胞密度并不隨保

7、存時間延長而明顯下降，角膜內(nèi)皮細胞的活性均在85％以上。 2、異體濕房保存組(Ⅰ組)。MST為10.4d±1.70d，異體中期保存液保存組(Ⅱ組)MST為12.9d4±1.81d，異體深低溫保存組(Ⅲ組)MST為16.1d±2.57d。異體深低溫保存組MST明顯延長，與其他兩組比較均有顯著性P<0.01。Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組于術后10d時角膜植片水腫、混濁程度及新生血管范圍依次減輕。角膜移植術后10d時HE染色顯示Ⅲ組免疫排斥反應較

8、輕微，單核細胞和淋巴細胞浸潤和新生血管情況較Ⅰ組、Ⅱ組明顯減輕，Ⅱ組較Ⅰ組明顯減輕。免疫組化染色顯示Ⅲ組ICAM-1表達較Ⅰ組、Ⅱ組明顯減弱。Ⅲ組眶血清及房水中TNF-a含量為(213.76±19.06pg/mL，203.17±16.62 pg/mL)明顯低于Ⅱ組(269.08±14.28 pg/mi，240.87±9.28 pg/mL)和Ⅰ組(336.51±38.50 pg/mL，284.83±28.76 pg/mL)，差異有顯著性P