MUC1靶向脂質—聚合物雜化納米粒的構建及體外評價.pdf

1、一、研究背景及目的：
　　主動靶向制劑是抗腫瘤藥物新劑型研究的主要方向，脂質-聚合物雜化納米粒(Lipid-polymer hybrid nanoparticle)是一類基于脂質體和聚合物納米粒發(fā)展的新型載藥系統(tǒng)，在腫瘤靶向給藥方面優(yōu)勢獨特。MUC1蛋白是大多數腫瘤細胞表面異常表達的糖蛋白，是一種廣譜腫瘤靶標分子。本課題以核酸適配體(Aptamer，Apt) S2.2作為靶向配體，難溶性抗腫瘤化合物長春瑞濱(Vinorelbine

2、，VRL)作為模型藥物，采用自組裝法構建載藥脂質．聚合物雜化納米粒(Apt-NP/VRL)用于表達MUC1蛋白的腫瘤細胞靶向遞藥。通過制備不同S2.2密度的Apt-NP/VRL，研究表面S2.2密度對納米粒制劑特性及靶向作用的影響。
　　二、方法與結果：
　　1.靶向脂質．聚合物雜化納米粒的制備和表征
　　以VRL作為模型藥物，大豆卵磷脂、DSPE-PEG2000-COOH和聚乳酸羥基乙酸(poly(lactic-co

3、-glycolic acid，PLGA)為載體材料，采用自組裝法構建載藥脂質-聚合物雜化納米粒（NP/VRL）。首先評價處方中影響制劑學特性的關鍵因素，再以正交設計優(yōu)化NP/VRL處方。利用3'末端氨基修飾的核酸適配體S2.2(Apt)與DSPE-PEG2000-COOH鍵合生成DSPE-PEG2000-Apt。在優(yōu)化處方的基礎上，固定DSPE用量，通過調節(jié)DSPE-PEG2000-Apt與DSPE-PEG2000-COOH的比例制備不

4、同適配體密度的納米粒（Apt-NP/VRL）并對其進行表征。
　　正交設計優(yōu)化的處方為脂質占PLGA的15％，DSPE-PEG2000-COOH占脂質的60％，藥載比15∶100，PLGA濃度為8mg·mL-1，水相有機相體積比為1∶2。本文共制備了6種Apt密度的納米粒，根據DSPE-PEG2000-Apt占DSPE總量的摩爾比例分別記作Apt0-NP/VRL、Apt0.5-NP/VRL、Apt1-NP/VRL、Apt2-NP/

5、VRL、Apt5-NP/VRL、Apt10-NP/VRL。X射線光電子能譜證明Apt成功鍵合在納米粒表面。透射電鏡觀察Apt-NP/VRL形態(tài)呈規(guī)則的球形，表面光滑圓整。Apt密度對納米粒的粒徑、粒徑分布、zeta電位等制劑特性無影響。Apt-NP/VRL的粒徑為128.1～166.5 nm，zeta電位為-23.7～-31.6 mV，包封率為50.42～57.88％。納米粒在PBS(pH7.4)溶液中132 h累積釋藥小于50％，具有

6、緩釋性。
　　2.靶向脂質-聚合物雜化納米粒的細胞攝取研究
　　采用流式細胞術篩選人乳腺癌細胞MCF-7作為MUC1陽性細胞，人肝癌細胞HepG2作為MUC1陰性細胞。以熒光染料香豆素-6(Cou-6)為探針研究攝取行為。采用熒光顯微鏡定性觀察Apt10-NP/Cou-6和Apt0-NP/Cou-6對細胞的選擇性。采用酶標儀測定細胞的熒光強度，定量考察不同Apt密度納米粒的細胞攝取率，評價納米粒的靶向性并研究適配體密度對選擇

7、性攝取的影響。
　　結果表明，Apt-NP/Cou-6的粒徑分布、zeta電位等與Apt-NP/VRL一致，且Cou-6在PBS(pH7.4)溶液中24 h內累積泄漏量小于5％，說明Apt-NP/Cou-6可示蹤納米粒的體內或細胞跨膜轉運行為。熒光顯微鏡顯示納米?？稍? h內進入細胞質，MCF-7細胞對Apt10-NP/Cou-6的攝取率高于Apt0-NP/Cou-6，說明Apt-NP/Cou-6與MUC1蛋白的特異性結合有利于納

8、米粒的攝取。未表達MUC1蛋白的HepG2細胞對Apt10-NP/Cou-6的攝取低于Apt0-NP/Cou-6，可能與Apt增加納米粒負電性有關。MCF-7細胞和納米粒共同孵育1h后，與Apt0-NP/Cou-6相比， Apt0.5-NP/Cou-6、Apt1-NP/Cou-6、Apt2-NP/Cou-6、Apt5-NP/Cou-6、Apt10-NP/Cou-6的細胞攝取率由（11.6±1.2）％分別增至（15.7±1.4）％、（16

9、.8±0.7）％、(18.8±2.3)％、（23.9±3.8）％、（24.6±4.6）％。說明增加納米粒表面S2.2的修飾密度，納米粒的靶向性增強。
　　3.靶向脂質-聚合物雜化納米粒的體外抗腫瘤活性研究
　　采用MTT法測定細胞活性，考察Apt-NP/VRL的細胞毒性，評價Apt-NP/VRL的體外抗腫瘤活性。結果表明，Apt-NP/VRL對MUC1陽性細胞的活性抑制高于對照細胞，Apt0.5-NP/VRL、Apt1-NP

10、/VRL、Apt2-NP/VRL、Apt5-NP/VRL、Apt10-NP/VRL對MCF-7細胞的抑制率分別是HepG2細胞的1.3、1.5、1.6、1.5、1.7倍。提示Apt-NP/VRL可以特異性地識別并殺傷MUC1陽性細胞。
　　分別制備一系列VRL濃度的Apt-NP/VRL溶液，與MCF-7細胞共同孵育24 h，測定Apt-NP/VRL的IC50值，研究適配體密度對靶向抗腫瘤活性的影響。結果表明，隨著S2.2的修飾密度

11、增加，納米粒的細胞毒性逐漸增強(p＜0.05）。與非靶向納米粒Apt0-NP/VRL相比，靶向納米粒Apt0.5-NP/VRL、Apt1-NP/VRL、Apt2-NP/VRL、Apt5-NP/VRL、Apt10-NP/VRL的IC50值由（21.3±0.2）μg·mL-1分別減小至（19.2±0.1）、（15.4±0.2）、（10.3±0.2）、（8.7±1.0）、（7.2±0.4）μg· mL-1。
　　三、結論：
　　以