RNAi敲除SMAC基因?qū)Ψ伟┘毎L及順鉑耐藥性影響的實驗研究.pdf

1、第一部分：
　　 目的：構(gòu)建針對目的基因SMAC的RNAi 質(zhì)粒載體，并在篩選出有效干擾靶點后進行慢病毒包裝及細胞感染穩(wěn)定株的制備。
　　 材料和方法：
　　 1、針對目的基因靶基因序列，利用公用網(wǎng)站按照RNA 干擾序列設(shè)計原則，設(shè)計多個RNA 干擾靶點序列，根據(jù)設(shè)計軟件進行評估測定，選擇最佳的動力學參數(shù)靶點進入后續(xù)實驗流程；由吉凱基因公司合成含干擾序列的雙鏈DNAoligo，其兩端含酶切位點粘端，直接連入酶切后

2、的RNA 干擾載體上。將連接好后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的細菌感受態(tài)細胞，對長出的克隆進行PCR鑒定，在進行測序?qū)Ρ群?，比對正確的克隆即為構(gòu)建成功的目的質(zhì)粒。
　　 2、為了確定復合載體是否轉(zhuǎn)染到人肺癌細胞中，在熒光顯微鏡下觀察感染Smac基因-RNAi-慢病毒載體后72 小時A549細胞中報告基因GFP的表達。RT-PCR和Western 印跡分析轉(zhuǎn)染Smac基因-RNAi-慢病毒載體前后，Smac在mRNA和蛋白水平的沉默效果。

3、r>　　 3、將編碼慢病毒顆粒的重組病毒顆粒及其兩種輔助包裝載體質(zhì)粒分別進行高純度無內(nèi)毒素抽提，按lipofectamine2000 試劑盒使用說明進行共轉(zhuǎn)染T293細胞，轉(zhuǎn)染后按說明書進行培養(yǎng)，之后收集、濃縮富含慢病毒顆粒的細胞上清液，在T293細胞中測定并標定病毒滴度。
　　 結(jié)果：
　　 1、含有vshRNA 片段的psc-1 克隆為所成功構(gòu)建的含有siRNA 靶序列載體。
　　 2、A549細胞在轉(zhuǎn)染了

4、上述慢病毒72 小時后，超過80％的A549細胞表達了marker基因GFP，表明該轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的高效和穩(wěn)定、SMAC基因在敲除后在mRNA（抑制效率約為70％，P 值＜0.01）和蛋白水平都較敲除前有顯著意義于，表明RNAi有效靶點篩選成功。
　　 3、工具細胞與病毒載體進成功行包裝并制備細胞感染的穩(wěn)定株。
　　 結(jié)論：SMAC RNAi 干擾質(zhì)粒載體成功構(gòu)建并篩選出RNAi 有效靶點，對其進行慢病毒包裝與滴度測定后制備了

5、細胞感染的穩(wěn)定株，這為后續(xù)對SMAC基因進行功能研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分：
　　 目的：針對目的基因SMAC 構(gòu)建過表達的慢病毒載體，為后續(xù)基因功能研究準備載體工具。
　　 材料和方法：
　　 1、從含目的基因的質(zhì)?；騝DNA文庫中，用PCR釣取目的基因。由吉凱基因公司進行目的基因的引物合成與鑒定，對目的基因進行PCR擴增、酶切，表達載體酶切、純化，定向克隆連接重組后與感受態(tài)細胞共轉(zhuǎn)染，PCR鑒定

6、轉(zhuǎn)化子，送invitrogen 公司進行陽性克隆測序和比對分析，比對正確的克隆即為構(gòu)建成功目的質(zhì)粒。
　　 2、在目的細胞A549中，通過轉(zhuǎn)染含有Smac 全長編碼序列的pGC-FU 載體來實現(xiàn)Smac 高表達，轉(zhuǎn)染pGC-FU 載體的siRNA在C-末端含有marker基因GFP，通過western blot 觀察轉(zhuǎn)染前后Smac 蛋白水平的變化對過表達慢病毒載體的效果進行驗證。
　　 3、按lipofectamine

7、 2000 使用說明進行共轉(zhuǎn)染T293細胞，轉(zhuǎn)染后按說明書進行培養(yǎng)并進行收集、濃縮病毒液并進行滴度的測定。
　　 結(jié)果：含有Smac 全長編碼序列的pGC-FU 載體高表達目的基因SMAC，并在蛋白水平得到驗證。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建目的基因SMAC 過表達慢病毒載體，為后續(xù)SMAC基因進行功能研究提供了可靠工具。
　　 第三部分：
　　 目的：探討慢病毒介導RNAi 敲除Smac基因前后對肺癌細胞生長及

8、順鉑耐藥性的影響，并且通過轉(zhuǎn)染含有Smac 全長編碼序列的pOE 載體來實現(xiàn)Smac的高表達，以來進一步驗證Smac 對肺癌細胞生長和對順鉑耐藥性的影響。從正反兩方面來相互驗證，以來為進一步研究Smac在肺癌細胞生長及對順鉑耐藥性的可能機制奠定基礎(chǔ)。
　　 材料和方法：
　　 1、用慢病毒介導RNAi 敲除Smac基因，用MTT，細胞克隆形成試驗，Annexin V-PI 雙染流式細胞儀檢測凋亡等手段來檢測A549和95

9、D細胞敲除Smac基因前后增殖能的力變化。
　　 2、用MTT、Annexin V-PI 雙染流式細胞儀檢測順鉑干預前后和Smac基因敲除前后細胞生長情況和凋亡比率的變化來研究其對順鉑耐藥的影響。
　　 3、用轉(zhuǎn)染含有Smac 全長編碼序列的pOE 載體來實現(xiàn)Smac高表達的A549細胞系，用MTT 實驗、Brdu 增殖試驗來檢測順鉑干預前后細胞生長能力的變化來進一步驗證Smac基因?qū)Ψ伟┘毎L及順鉑耐藥性的影響。

10、r>　　 結(jié)果：
　　 1、MTT分析法和克隆形成試驗觀察S mac基因敲除后對肺癌細胞系A(chǔ)549和95D 生長的影響，與pNC-轉(zhuǎn)染細胞相比，pKD-轉(zhuǎn)染細胞的增殖顯著增加，說明Smac基因敲除后促進人肺癌細胞生長。
　　 2、在克隆形成試驗中，pKD-轉(zhuǎn)染細胞的細胞克隆量和大小與pNC-轉(zhuǎn)染細胞相比有顯著增加，提示Smac基因敲除促進肺癌細胞系A(chǔ)549的集落形成能力。
　　 3、流式細胞計數(shù)檢測也表明Sma

11、c基因敲除可抑制順鉑誘導的細胞調(diào)亡。在A549和95D 兩種細胞系中，Smac下調(diào)時，早期和晚期調(diào)亡細胞的比例(LR和UR）大大下降；細胞存活率則顯著增加。
　　 4、pOE-轉(zhuǎn)染的細胞系A(chǔ)549 Smac 蛋白表達明顯增加，證明了慢病毒介導的Smac 高表達。與Smac基因敲除相反，Smac 高表達顯著抑制A549細胞生長，并且增強其對順鉑的敏感性，從另一方面證明了Smac在肺癌細胞生長和藥物耐藥中的重要作用。