生物節(jié)律相關基因BMAL1和CRY1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的功能和機制探討.pdf

1、從正常人全腦marathoncDNA中克隆到人生物節(jié)律基因BMALl和CRYl的開放讀碼框架(ORF)，經酶切和測序鑒定與GeneBank數(shù)據(jù)庫中收錄的序列基本一致。其中BMALl定位于染色體1lpl5，含有20個外顯子和19個內含子；編碼蛋白626aa,分子量為68kDa；蛋白序列與已知的ARNT和AHR高度同源，為含有bHLH-PAS結構的轉錄調控因子；在果蠅、爪蟾、小鼠、大鼠和人等生物中均有同源物表達。CRYl定位于12q23—2

2、4．1，含13個外顯子和12個內含子；編碼蛋白586aa,分子量66kDa；蛋白序列與果蠅photolyase同源，兩種CRY蛋白結構上同源性高，都含有DNAphotolyase和FADDNAbinding結構域；從果蠅到小鼠和人都可以發(fā)現(xiàn)CRYl的同源物表達。 通過Northern雜交MTN多組織膜片顯示，BMALl有3個轉錄本，分別為2．0kb、2．8kb和5．0kb,其在心、胎盤、肝、骨胳肌和腎中都有較高水平的表達；CRY

3、l有1個約3．0kb的轉錄本，在各種正常人組織中都有表達。RT-PCR也可以從正常肝組織、胎盤、卵和腦中擴增出BMALl與CRYl基因片段。說明BMALl與CRYl可以在各種人正常組織中表達。通過RT-PCR在4種肝癌細胞，2種腦膠質瘤細胞，2種肺癌細胞，乳腺癌細胞，卵巢癌細胞，宮頸癌細胞，骨肉廟細胞等13種腫瘤細胞中檢測到BMALl和CRYl的表達。說明這兩種生物節(jié)律基因不僅在各種人正常組織中表達，同樣在離體培養(yǎng)的腫瘤細胞中也可以表達

4、。 為了檢測BMALl與CRYl在肝癌與癌旁組織中的表達差異，分別使用了Northernblot、半定量RT-PCR和免疫組織化學方法分析。Northernblot結果顯示，在8對肝癌與癌旁組織中,BMALl和CRYl均在87．5％(7／8)癌旁組織中有相對高的表達；反轉錄PCR檢測另外8對肝癌與癌旁組織結果為，BMALl和CRYl在62．5％(5／8)的癌旁組織中有相對高的表達；免疫組化分析163對肝癌與癌旁組織中BMALl的

5、表達在癌旁組織(53％)高于肝癌(23％)，而CRYl在185對樣品中也于癌旁組織(29％)高于肝癌中(12％)。以上試驗說明，BMALl和CRY1-基因在肝癌及對應的癌旁組織中都有表達，而且在同樣的樣品中呈現(xiàn)癌旁表達高于肝癌組織的趨勢。 GFP亞細胞定位確定二者均定位于細胞核中，與以前在其它生物中細胞定位的結果一致，說明二者的生物作用主要發(fā)生在核內。將BMALl與CRYl均亞克隆到真核表達載體穩(wěn)定轉染SMMC-7721細胞，通