Mash1基因過表達的骨髓間充質干細胞治療癲癇的實驗研究.pdf

1、癲癇是發(fā)病率最高的中樞神經系統(tǒng)功能障礙,表現為慢性、反復發(fā)作的大腦神經元異常放電。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)的數據顯示,全球癲癇患者約為五千萬至一億,并且全球約5％的人群一生中具有罹患癲癇的風險。癲癇患者中有約30%行藥物治療效果欠佳,而藥物治療之外的手術治療以及神經電刺激治療(迷走神經電刺激術(vagus nerve stimulation,VNS)、腦深部電刺激治療(deep brai

2、n stimulation,DBS))等并不適合于所有癲癇患者特別是無手術指征者,因此,有必要尋找更有效、安全、持久的新治療方法。
　　腦內伽馬氨基丁酸(gamma-amino butyric acid,GABA)能神經元減少會導致癲癇是目前了解的可能核心機制。研究顯示,源自不同類別干細胞(胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)、神經干細胞(neural stem cells,NSCs)、間充質干細胞(m

3、esenchymal stem cells,MSCs)等)的GABA能神經元可以抑制癇性發(fā)作、延長模型動物生存期,因此,大量學者把目光聚焦于基于干細胞的癲癇治療策略。但細胞來源無法滿足需求成為個中羈絆。
　　間充質干細胞因具有自我更新和多向分化潛能的特性使其成為細胞治療策略的優(yōu)良候選細胞并逐漸成為熱點。作為間充質干細胞中的一員,骨髓間充質干細胞(bone morrow mesenchymal stem cells,BMSCs)來源

4、于骨髓,它在人體內分布廣泛,易于提取、分離,而且在應用于自體時不存在免疫排斥以及倫理學障礙,有研究顯示BMSCs移植治療可以抑制癲癇動物模型的自發(fā)性癇性發(fā)作(spontaneous recurrent seizure,SRS)的頻率。使用其進行移植治療并使之與宿主神經元形成突觸聯系幫助其功能重建是有可能實現的。但針對在癲癇模型中起關鍵作用的GABA能神經元的間充質干細胞來源的特異性分化以及用其治療癲癇以促進療效的研究很少。盡管有研究顯示

5、BMSCs可以經條件誘導培養(yǎng)向GABA能神經元樣細胞分化,但需使用化學成分(如氯化鉀(potassium chloride,Kcl),β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol,BME),維甲酸(retinoic acid,RA)等)或細胞因子(如堿性成纖維細胞生長因子)等,上述方案如果應用于體內則不僅難以實現而且可能產生無法預期的副作用。
　　堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)基因

6、在干細胞的增殖與分化過程中起著重要的作用,其中,促分化轉錄因子哺乳動物無剛毛-鱗甲同源物(mammalian achaete-scute homologue,Mash1)基因作為bHLH家族中的一員,它不僅啟動神經干細胞分化成神經元的過程,而且同時決定著神經元亞型的形成,與GABA能神經元的分化形成有著密切的關系。本研究假設,過表達BMSCs中的Mash1基因將可促進其向 GABA能神經元樣細胞分化。本研究采用慢病毒轉染技術使BMSCs

7、過表達Mash1基因,通過條件誘導培養(yǎng)技術誘導分化為GABA能神經元樣細胞,對比BMSCs和Mash1過表達的BMSCs向GABA能神經元樣細胞分化的比率以驗證假設,并且將 Mash1過表達的BMSCs移植入癲癇大鼠模型體內,觀察其是否具有更進一步抑制癲癇的治療效果。
　　第一部分大鼠來源的骨髓間充質干細胞的提取、體外分離、培養(yǎng)和鑒定
　　目的:建立成熟高效的提取、分離與鑒定BMSCs的方法。
　　方法:無菌手術取材2

8、～3周齡大鼠的雙側股骨與脛骨,提取骨髓,分別使用全骨髓貼壁培養(yǎng)法和應用Histopaque?分離液的密度梯度離心分離法分離細胞并培養(yǎng),采用流式細胞儀鑒定細胞表面分子標記并通過成脂肪、軟骨、骨誘導分化鑒定其多向分化潛能,使用噻唑藍(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)檢測增殖曲線。
　　結果:與全骨髓貼壁培養(yǎng)法相比,密度梯度分離法獲得的BM

9、SCs雜質細胞少、細胞形態(tài)更標準并且均一,增殖曲線標準(接種第1～3天處于潛伏期,隨后進入對數生長期,至第7～9天時進入平臺期),同時細胞表面分子標記表達(密度梯度分離法提取并傳代得到的用于本實驗研究的P3(passage3)代BMSCs低表達CD34抗原((1.79±0.23)%,圖4-A)并且高表達CD105抗原((98.6±0.68)%,圖4-B)、CD90抗原((98.5±1.02)%,圖4-C)和CD73抗原((98.8±0.

10、98)%,圖4-D)及多向分化潛能均符合國際統(tǒng)一規(guī)范。
　　結論:密度梯度離心分離法可以高效、便捷地獲得純度高、擴增速度快、定向分化能力明確的符合國際統(tǒng)一規(guī)范的BMSCs,可以為下一步實驗研究提供優(yōu)良的細胞材料。
　　第二部分過表達Mash1基因促進骨髓間充質干細胞成GABA能神經元分化
　　目的:研究Mash1基因過表達對BMSCs成GABA能細胞分化的作用。
　　方法:提取2～3周Sprague-Dawley

11、(SD)大鼠的BMSCs,傳至第3代;制備搭載Mash1基因的慢病毒載體,轉染BMSCs使其Mash1基因過表達,采用復合誘導培養(yǎng)基(1×B27+1mM N6,O2二丁酰腺苷3’,5’-環(huán)磷酸(N6,O2’-dibutyryladenosine3’,5’-cyclicmonophosphate,Bt2cAMP)+1μMATRA+Neurobasal)體外誘導Mash1+-BMSCs和BMSCs成GABA能神經元分化并做免疫細胞化學染色、

12、PCR檢測和Western blot檢測驗證它們的分化趨勢,同時行全細胞膜片鉗檢測了解分化細胞的電生理學特性。
　　結果:搭載Mash1基因的慢病毒轉染(感染指數MOI=100)BMSCs后Western blot檢測結果顯示 Mash1表達獲得顯著提高;成 GABA能神經元分化過程中Mash1+-BMSCs組(M-BMSCs)表現出更多的具有神經元形態(tài)特征的細胞;誘導分化后Western blot和RT-PCR檢測顯示Mash1

13、+-BMSCs組的細胞表達神經元特異性核蛋白（neuron-specific nuclear protein,NeuN)和谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase,GAD)67的水平顯著高于對照組細胞;分化后細胞的細胞免疫熒光檢測顯示M-BMSCs組(71.6±2.8)%中GAD67免疫熒光陽性比率明顯高于BMSCs組(61.4±5.3)%、Lv-con-BMSCs組(58.6±5.4)%和M-con-BMS

14、Cs組(0),并且,M-BMSCs組(72.0±2.0)%中GABA免疫熒光陽性比率明顯高于BMSCs組(61.4±2.9)%、Lv-con-BMSCs組(62.4±5.5)%和M-con-BMSCs組(0);全細胞膜片鉗檢測到成神經元分化的細胞具有動作電位和自發(fā)性抑制性突觸后電位提示其具有功能性。
　　結論:慢病毒介導的基因過表達具有良好的效果;Mash1基因過表達可以促進BMSCs向具有電生理活性的GABA能神經元分化。

15、>　　第三部分 Mash1基因過表達的骨髓間充質干細胞對大鼠癲癇模型的治療研究
　　目的:研究 Mash1基因過表達的BMSCs(M-BMSCs)對癲癇模型大鼠的治療作用。
　　方法:60只 SD大鼠行水迷宮訓練形成空間記憶后使用匹魯卡品誘導制作癲癇模型并入組達到RacineⅤ級發(fā)作的大鼠;使用BrdU體外標記M-BMSCs和BMSCs并通過立體定向聯合微量注射技術將 M-BMSCs(M-BMSCs組)、BMSCs(BMSC

16、s組)或大鼠成纖維細胞(陽性對照組)注射入癲癇大鼠右側腦室完成細胞移植(細胞數量5×105個/只);其后選取不同時間點(移植后第7,14,21,28天)進行功能學(水迷宮檢測、自發(fā)性癲癇發(fā)作頻率監(jiān)測)、電生理(EEG)以及免疫組織化學(石蠟切片免疫熒光染色、尼氏染色、二氨基聯苯胺(diaminobenzidine,DAB)染色)檢測研究大鼠空間記憶能力、腦電圖變化和神經元細胞層面在細胞移植之后產生的變化。
　　結果:細胞移植治療對

17、大鼠因癲癇導致的空間記憶能力損害具有保護作用,在移植第7天細胞移植的保護作用開始出現,M-BMSCs組的保護作用的特點是出現早、效果明顯(逃避潛伏期時間恢復至接近正常大鼠水平),相比較而言,BMSCs組的效果與M-BMSCs組存在差異(P<0.05);細胞移植治療不僅可以降低大鼠造模后的死亡率(雖然各組數據間無統(tǒng)計學差異,但M-BMSCs組和BMSCs組的死亡數量仍是低于陽性對照組的),而且可以減低SRS的發(fā)生(雖然統(tǒng)計分析未見明顯差異

18、,但是在M-BMSCs組和BMSCs組仍可見SRS頻率的減少),并且在EEG電生理水平也表現出促進恢復的作用:細胞移植治療后,與陽性對照組相比,M-BMSCs組和BMSCs組的棘波和棘慢波的數量顯著減少(P<0.05),而且M-BMSCs組的效果優(yōu)于BMSCs組;免疫熒光雙標檢測發(fā)現M-BMSCs組的大鼠腦內海馬旁皮層NeuN+/BrdU+共表達細胞和GAD67+/BrdU+共表達細胞比率高于BMSCs組大鼠;尼氏染色計數海馬旁皮層空泡