Append融合蛋白的表達(dá)、純化及活性鑒定.pdf

1、據(jù)世界衛(wèi)生組織的最新統(tǒng)計(jì)，腫瘤的發(fā)病率和死亡率繼心血管疾病、感染性疾病之后位居第三，是危害人類健康最嚴(yán)重的疾病之一。目前，腫瘤的臨床治療包括：手術(shù)治療、放療和化療。手術(shù)雖然能夠切除腫瘤組織，但治療效果并不樂觀。使用放、化療殺傷腫瘤細(xì)胞時(shí)，正常組織和細(xì)胞也同樣受到損傷，導(dǎo)致出現(xiàn)并發(fā)癥。 所以，尋找特異性的腫瘤細(xì)胞殺傷藥物成為了腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。 研究表明細(xì)胞的無限制增殖和腫瘤新生血管的形成是腫瘤生長(zhǎng)過程中的兩個(gè)關(guān)鍵因

2、素，如果抗腫瘤藥物能夠同時(shí)瞄準(zhǔn)以上兩個(gè)目標(biāo)，既能抑制腫瘤細(xì)胞增殖又能抑制血管新生，采取“多個(gè)靶點(diǎn)”方式攻擊，就能獲得更好的臨床效果。 凋亡素(Apoptin)是一種來源于雞貧血病病毒(chicken anemia virus，CAV)的小蛋白質(zhì)(VP3)，由121個(gè)氨基酸組成，分子量為13.6kDa，它能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但對(duì)正常細(xì)胞不造成損傷。一系列的研究結(jié)果表明Apoptin有望成為腫瘤特異性治療和診斷試劑。 人內(nèi)

3、皮抑素(Endostatin)為膠原蛋白ⅩⅧ的C末端片段，編碼184個(gè)氨基酸，分子量為18.5kDa，是近年來發(fā)現(xiàn)的最有效的血管生成抑制因子之一。作為一種特異性血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子，內(nèi)皮抑素可以明顯抑制新生血管的生成、腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。 基于上述考慮，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建一種新的融合基因，命名為Append，其表達(dá)產(chǎn)物為以柔性多肽--甘氨酸接頭(Gly4Ser)3將Apoptin與Endostatin連接起來的融合蛋白。希望該融合蛋

4、白兼具Apoptin與Endostatin的生物功能，為腫瘤治療提供一種新策略。 本研究通過PCR從pLLP-OmpA-Append質(zhì)粒中擴(kuò)增Append基因片段，將純化的片段克隆至pGEM-T Easy載體中，經(jīng)酶切PCR及序列測(cè)定驗(yàn)證，結(jié)果表明獲得了全長(zhǎng)為960bp的Append基因片段；將測(cè)序正確的Append基因片段亞克隆進(jìn)pET-His表達(dá)載體中，經(jīng)酶切和PCR鑒定正確的載體命名為pET-His-Append。

5、 將上述陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入Ecoli BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞中，挑取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化出的單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，待OD600約為0.5加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，1.5h后收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析及Western blotting驗(yàn)證，結(jié)果表明獲得的目的蛋白大小與預(yù)期相符，約為35kDa；經(jīng)表達(dá)條件的優(yōu)化，確定了pET-His-Append最適表達(dá)條件為37℃誘導(dǎo)2.5h，誘導(dǎo)劑IPTG的濃度為80μg/mL，其中目的蛋白(包涵

6、體)占菌體蛋白的34.9％。采用鎳瓊脂糖親和層析法對(duì)表達(dá)的包涵體進(jìn)行純化，通過改變洗脫液(咪唑)濃度來獲得目的蛋白，最終獲得Append融合蛋白濃度為1.43mg/L，純度為93.6％。 純化后的融合蛋白通過MTT及CAM實(shí)驗(yàn)分析其對(duì)新生血管的作用，通過形態(tài)學(xué)觀察、DNA片斷化檢測(cè)及流式細(xì)胞儀分析其對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用，結(jié)果表明Append融合蛋白在體內(nèi)可以抑制血管的新生，在體外可以抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖并可誘導(dǎo)人神經(jīng)膠質(zhì)