RNA干擾沉默CTGF對人成骨樣MG63細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-1和基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達的影響.pdf

1、第一部分RNA干擾沉默CTGF對人成骨樣MGG63細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-1和基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達的影響。 目的:我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，雌二醇可下調(diào)人成骨樣MG63細胞CTGF的表達，但人成骨樣MG63細胞CTGF表達下調(diào)所引起的生物學效應尚不清楚。本研究用RNA干擾技術，阻斷CTGF在人成骨樣MG63細胞中的表達，觀察CTGF降表達后對人成骨樣MG63細胞Ⅰ型膠原、堿性磷酸酶、基質(zhì)金屬蛋白酶-1和基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達的影響。并觀

2、察抑制CTGF的內(nèi)源性的表達對人成骨樣MG63細胞活力的影響。 方法:針對人CTGF mRNA 440、875、910位點設計、合成三對21核苷酸siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3)；在陽離子脂質(zhì)體介導下轉(zhuǎn)染人成骨樣MG63細胞，以空白及非特異性siRNA作為對照，轉(zhuǎn)染48h后收集細胞。采用Northern雜交觀察CTGF mRNA表達水平的改變，半定量RT—PCR觀察Ⅰ型膠原、ALP、MMP-1、MMP-2

3、mRNA表達的改變，western blotting觀察CTGF、MMP-1、MMP-2蛋白表達的變化。MTT法測定RNA干擾后人成骨樣MG63細胞活力。 結果:體外轉(zhuǎn)錄合成的siRNAl(對應于440位點)、siRNA3(對應于910位點)轉(zhuǎn)染人成骨樣MG63細胞后，能抑制CTGF mRNA和蛋白的表達，其中siRNAl的抑制作用更為顯著，可將CTGF蛋白抑制達70％以上，siRNA2(對應于875位點)對人成骨樣MG63細胞

4、CTGF的表達無明顯作用；在siRNA1、siRNA3組，隨CTGF表達下調(diào)，成骨細胞的Ⅰ型膠原、ALP mRNA表達明顯下調(diào)，而在siRNA2組Ⅰ型膠原、ALP mRNA表達則無明顯變化；在siRNA1、siRNA3組，隨CTGF表達下調(diào)，MMP-1mRNA和蛋白表達明顯下調(diào)，而MMP-2 mRNA、蛋白表達均無明顯變化。此外，我們還觀察到，CTGF表達下調(diào)使siRNA1組和siRNA3組的人成骨樣MG63細胞存活率顯著降低。

5、 結論:CTGF表達下調(diào)可抑制MG63細胞Ⅰ型膠原、ALP、MMP-1mRNA的表達，下調(diào)MMP-1蛋白的表達，降低MG63細胞活力，但對MMP-2 mRNA及蛋白表達無明顯變化。說明CTGF是維持人成骨樣MG63細胞存活、正常分化所必需的細胞因子；CTGF可能通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達在維持骨代謝平衡中發(fā)揮重要的作用。 第二部分重組人結締組織生長因子對人成骨細胞增殖、分化及凋亡的影響。 目的:研究重組人結締組織生長因

6、子(recombinant human connective tissue growth factor rCTGF)對人成骨細胞增殖、分化及凋亡的影響。 方法:用rCTGF干預體外培養(yǎng)的人成骨細胞，采用<'3>H-TdR摻入法檢測人成骨細胞增殖率，α-磷酸萘酚法測定細胞內(nèi)堿性磷酸酶活性變化，放免法測定骨鈣素含量的變化，western blotting檢測Ⅰ型膠原表達的變化，應用流式細胞儀檢測rCTGF對成骨細胞凋亡的影響；采用熒

7、光染料吖啶橙和溴化乙錠染色，激光共聚焦顯微鏡觀察rCTGF對細胞凋亡的影響。 結果: rCTGF呈劑量依賴性促進人成骨細胞增殖，200ng/mL rCTGF達最大促增殖效應；rCTGF干預顯著促進人成骨細胞分化，rCTGF呈劑量依賴性增加Ⅰ型膠原、骨鈣素表達及堿性磷酸酶活性；rCTGF干預可無血清誘導的成骨細胞凋亡減少48％，激光共聚焦顯微鏡觀察結'果顯示200ng/mL rCTGF干預組凋亡細胞數(shù)明顯減少。 結論:rC

8、TGF可顯著促進人成骨細胞的增殖和分化，并抑制人成骨細胞凋亡。CTGF通過增加成骨細胞的數(shù)量、增加骨基質(zhì)的合成，具有刺激骨形成的作用。因為rCTGF僅含成熟CTGF C-末端結構域，所以CTGF主要通過其C-末端結合區(qū)發(fā)揮促進人成骨細胞增殖、分化的生物學效應。 第三部分重組人結締組織生長因子對人成骨細胞護骨素/核因子K B受體活化配體表達的影響。 目的:研究重組人結締組織生長因子(recombinant human co

9、nnective tissue growth factor rCTGF)對體外培養(yǎng)的人成骨細胞護骨素/核因子kB受體活化配體表達的影響，探討結締組織生長因子調(diào)節(jié)護骨素/核因子kB受體活化配體表達的信號轉(zhuǎn)導機制。 方法:用重組人結締組織生長因子干預體外培養(yǎng)的人成骨細胞，采用 western blotting檢測護骨素/核因子kB受體活化配體蛋白表達水平的變化，同時觀察重組結締組織織生長因子對人成骨細胞焦點黏附酶(focal adh

10、esion kinase FAK)、絲裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase MAPK)及AKT磷酸化的影響。 結果: rCTGF可呈時間一劑量依賴性地抑制人成骨細胞RANKL的表達，200ng/ml CTGF作用24～48h達最大抑制效果，而對人成骨細胞OPG的表達無明顯影響。rCTGF可明顯增強p38-MAPK磷酸化，并減少FAK磷酸化，rCTGF干預對p42/44 MAPK、J

11、NK及AKT磷酸化無明顯影響；p38-MAPK阻斷劑SB 23058可阻斷rCTGF對RANKL表達的抑制效應。 結論: rCTGF通過增強p38-MAPK磷酸化，減少FAK磷酸化，下調(diào)人成骨細胞RANKL的表達。CTGF通過降低人成骨細胞RANKL的表達，可抑制破骨細胞的形成，從而有助于骨代謝平衡的維持。 第四部分重組人結締組織生長因子對人成骨細胞膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1及基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達的影響。 目的:研

12、究重組人結締組織生長因子(recombinant human connective tissue growth factor rCTGF)對體外培養(yǎng)的人成骨細胞膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1及基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達的影響，并探討結締組織生長因子調(diào)節(jié)膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1及基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達的信號轉(zhuǎn)導機制。 方法:用重組人結締組織生長因子干預體外培養(yǎng)的人成骨細胞，采用 westem blotting檢測膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1及基質(zhì)金屬

13、蛋白酶-2蛋白表達水平的變化，同時觀察重組結締組織織生長因子對人成骨細胞MAPK及AKT磷酸化的影響。 結果: rCTGF可呈時間-劑量依賴性地促進人成骨細胞膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1及基質(zhì)金屬蛋白酶-2的表達，200ng/mlCTGF作用24～48h達最大效果。rCTGF可明顯增強p38-MAPK磷酸化，p38-MAPK阻斷劑SB 23058可阻斷rCTGF上調(diào)膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1及基質(zhì)金屬蛋白酶一2的效應。 結論: r