熱處理和化學處理對梨離體植株中病毒的影響.pdf

1、蘋果莖溝病毒（Apple stem grooving virus, ASGV）和蘋果褪綠葉斑病毒（Applechlorotic leaf spot virus，ACLSV）是梨樹上兩種重要病毒，廣泛分布于世界各梨、蘋果種植區(qū)。在梨樹上這兩種病毒通常不產(chǎn)生明顯的癥狀，但影響樹勢和降低產(chǎn)量。栽培無病毒種苗是減輕這些病毒危害的重要途徑，熱處理和化學處理是獲得無病毒果樹種質(zhì)的重要途徑。為探索適合這兩種病毒的脫病毒處理條件，建立更加有效的脫病毒技

2、術，本研究以砂梨離體植株為研究體系，對熱處理和化學處理進程中ASGV和ACLSV在離體植株及其莖尖的分布動態(tài)變化進行了研究，取得如下進展。 1．采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和RT-PCR技術相結合，對砂梨‘黃花’的20個芽系的ASGV和ACLSV，篩選出帶有這兩種病毒的芽系共13個，通過在MS培養(yǎng)基上擴繁，建立了用于本研究的離體培養(yǎng)體系。 2．采用組織免疫印跡技術對ASGV和ACLSV在‘黃花’離體植株莖干各部位分布

3、特點進行了分析，通過改進病毒抗體吸附方法和延長洗滌時間有效降低了非特異反應，根據(jù)最終產(chǎn)生紫色反應可以判斷病毒存在部位。采用該方法對植株縱切面印跡分析的結果表明，ASGV和ACLSV在‘黃花’離體植株莖干的頂端和基部含量均很高，莖干中部也有病毒分布，但反應顏色相對較淺。 3．合成了這兩種病毒的特異性生物素標記探針，建立了病毒斑點雜交和組織印跡原位雜交技術。采用組織印跡原位雜交技術對‘黃化’離體植株莖干縱切面和各部位的橫切面印跡進行

4、了病毒檢測，其結果與組織免疫印跡相似，但特異性更強，雜交后免疫檢測產(chǎn)生的紫色反應更明顯。 4．采用恒溫（37℃）和變溫（32℃／39℃，8h／16h交替）熱處理技術對‘黃化’離體植株進行了脫病毒處理，采用以上建立的免疫印跡和組織印跡原位雜交技術對處理不同時間進程中植株莖干病毒濃度變化進行了分析。結果顯示，在熱處理過程中植株莖干病毒含量隨處理時間的延長而逐漸降低，且莖干頂端病毒濃度的變化較基部更大，恒溫處理至35d或變溫處理至50

5、d后，莖尖基本無病毒產(chǎn)生的特異性紫色反應，而這種紫色反應在基部仍清晰可見。在處理不同時期，取1～5mm莖尖（37℃）或0.5～5mm（32℃／39℃）莖尖進行了再培養(yǎng)，采用ELISA對再生植株病毒檢測的結果顯示，所取莖尖越小或處理時間愈長，ELISA檢測吸光值愈低，表明隨著處理時間的延長，病毒含量自莖尖向基部逐漸降低，這種變化趨勢與組織印跡觀察到的現(xiàn)象一致。ELISA和斑點雜交的結果表明，恒溫處理35d后取1mm莖尖或變溫處理45d后取

6、0.5mm莖尖可以脫除ASGV和ACLSV。 5．比較熱處理再生植株的ELISA和斑點雜交檢測結果顯示，對未處理植株采用ELISA法可以有效檢測這兩種病毒，而經(jīng)熱處理后，植株體內(nèi)病毒含量降低，此時需采用更靈敏的斑點雜交技術以確保獲得無病毒種質(zhì)。 6．采用組織印跡原位雜交技術，對病毒醚處理離體植株莖干病毒含量變化進行初步分析的結果表明，經(jīng)病毒醚處理后，植株體內(nèi)病毒含量隨處理時間的延長而逐漸降低，處理至40d后莖尖病毒濃度明