紫杉醇聯(lián)合紫草素對U87腦膠質(zhì)瘤細胞的作用及機制初探.pdf

1、前言：
　　腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性腫瘤，具有高發(fā)病率、高復發(fā)率、高病死率、低治愈率等特點。近年來，化學治療已經(jīng)成為腦膠質(zhì)瘤特別是惡性腦膠質(zhì)瘤患者的主要治療方式。如今化療廣泛應用于臨床治療，然而單一藥物的應用常出現(xiàn)腫瘤耐藥等現(xiàn)象，故化療藥物的聯(lián)合應用已成為一種趨勢。
　　紫杉醇提取自從紫衫樹皮并作用于微管蛋白。它可加速微管二聚體形成微管，并防止其分離并抑制細胞的正常分裂;同時抑制其他因素對微管系統(tǒng)的作用，最終誘導細胞凋亡

2、。紫杉醇對多種腫瘤具有很好的療效，尤其針對耐藥性的腫瘤也取得了較好的進展。研究表明，ERK信號通路可促進細胞的分化與增殖，紫杉醇通過誘導細胞凋亡從而起抗癌作用的途徑可能與之相關。
　　紫草素作為傳統(tǒng)中藥材紫草的主要有效成分，已被證明具有抗炎、抗癌、調(diào)節(jié)免疫力等作用。紫草素類化合物的抗腫瘤作用機制主要包括誘導細胞自噬、凋亡、壞死，抑制蛋白酪氨酸激酶及拓撲異構酶，同時通過影響腫瘤細胞的信號通路達到預防和治療腫瘤的目的。
　　紫杉

3、醇和紫草素均為穩(wěn)定、高效的化療藥物，可通過對腫瘤細胞周期的阻滯及促進細胞凋亡而發(fā)揮抑制腫瘤生長、遷移及侵襲的作用。研究證實，紫杉醇和紫草素可分別增加及抑制p-ERK蛋白的表達。本研究的目的旨在首先探討是否可以通過應用紫草素來抑制紫杉醇對p-ERK蛋白表達的上調(diào)，從而提高紫杉醇的化療效果，進一步研究是否可以通過兩者的聯(lián)用實現(xiàn)化療藥物的協(xié)同作用，產(chǎn)生更好的抗癌效果，這為今后紫杉醇治療膠質(zhì)瘤及化療藥物的聯(lián)合應用提供了一定的實驗依據(jù)。
　

4、　實驗材料和方法：
　　一、實驗材料
　?。ㄒ唬嶒灱毎?br>　　人U87膠質(zhì)母細胞瘤細胞株由中國醫(yī)科大學細胞生物重點實驗室提供。
　?。ǘ┲饕噭?br>　　紫草素（中國藥品生物制品檢定所）;CCK-8（北京鼎國生物科技有限公司），DMSO，紫杉醇（美國Sigma公司），DMEM培養(yǎng)基（美國HyClone公司）;胎牛血清（北京鼎國生物科技有限公司）;Annexin Ⅴ/PI細胞凋亡檢測試劑盒（北京寶賽生物技術有

5、限公司）;細胞周期檢測試劑盒（北京鼎國生物科技有限公司）;小鼠抗p-ERK單克隆抗體，兔抗總ERK單克隆抗體（Abcam公司）;山羊抗兔HRP標記的IgG二抗，山羊抗小鼠HRP標記的IgG二抗。
　?。ㄈ┲饕獌x器
　　細胞培養(yǎng)箱（美國Forma scientific公司）;超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）;臺式低溫超速離心機（德國Sigma公司）;聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置（美國Bio-Rad公司）;轉印儀（北京市六一儀

6、器廠）;Las3000成像系統(tǒng)（日本FUJIFILM公司）;凝膠成像分析軟件（江蘇捷達科技有限公司）;電子分析天平（德國Sartorius公司）;-80℃超低溫冰箱（日本SANYO公司）;恒溫震蕩水?。ü枮I市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司）;旋渦混合器（上海醫(yī)科大學儀器廠）。
　　二、實驗方法
　?。ㄒ唬┠[瘤細胞培養(yǎng)
　　（二）實驗分組
　　1、對照組:PBS+U87細胞
　　2、紫杉醇組:紫杉醇(4.5μmo

7、l/l)+U87細胞
　　3、紫草素組:紫草素(2.5μmol/l)+U87細胞
　　4、1/2紫杉醇+1/2紫草素組:紫杉醇(2.25μmol/l)+紫草素(1.25μmol/l)+U87細胞
　?。ㄈ〤CK-8法檢測細胞增殖活性
　?。ㄋ模﹦澓蹖嶒炗^察細胞遷移能力
　?。ㄎ澹㏕ranswell遷移實驗測定細胞遷移能力
　?。㏕ranswell侵襲實驗測定細胞侵襲能力
　　（七）Anne

8、xinⅤ-FITC/PI檢測細胞凋亡
　　（八）細胞周期
　?。ň牛￤esternBlot方法檢測p-ERK/ERK的變化
　　（十）統(tǒng)計學處理
　　所有數(shù)值以均數(shù)±標準差（(X)±SD）表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，組間比較采用單因素方差分析（Dunnett-t檢驗），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　實驗結果：
　　一、紫杉醇與紫草素單獨以及聯(lián)合應用抑制U87細胞增殖<

9、br>　　采用CCK-8法檢測不同濃度的紫杉醇對U87細胞活力的影響。紫杉醇的給藥濃度分別為0μmol/L，0.1μmol/L，0.5μmol/L，2.5μmol/L，12.5μmol/L，25μmol/L。紫杉醇以濃度依賴性作用方式顯著抑制U87細胞活力。紫杉醇作用時間為24小時的U87細胞半數(shù)抑制率為8.97±0.23μmol/L。進一步應用9μmol/L紫杉醇觀察了不同時間的細胞活力的變化，紫杉醇作用12h、24h、48h均顯著降

10、低了U87細胞活力。
　　紫草素以濃度依賴性作用方式顯著抑制U87絀胞活力，與0μmol/L相比，濃度為4μmol/L、8μmol/L的紫草素均顯著抑制細胞活力。作用時間為24小時的U87細胞半數(shù)抑制濃度為5.02±0.44μmol/L。進一步應用5μmol/L紫草素觀察了不同時間的U87細胞活力的變化，紫草素作用12h、24h、48h均顯著降低了細胞活力。選擇24h作為給藥時間點，進行后續(xù)試驗。
　　選擇濃度為1/4IC5

11、0、1/2IC50及IC50濃度作為聯(lián)合應用時所用濃度，即分別選用濃度為2.25μmol/L、4.5μmol/L、9μmol/L的紫杉醇與濃度分別為1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L的紫草素聯(lián)合應用作用于U87細胞24h。CCK-8結果顯示:兩種藥物的聯(lián)用具有協(xié)同抑制U87細胞增殖的作用，其中4.5μmol/L紫杉醇與2.5μmol/L紫草素聯(lián)合應用組具有顯著的聯(lián)用價值(CDI=0.72)。
　　二、紫杉醇與

12、紫草素單獨以及聯(lián)合應用抑制U87細胞遷移
　　因紫杉醇及紫草素對U87遷移能力抑制較強，選用濃度為4.5μmol/L濃度紫杉醇、2.5μmol/L濃度紫草素及2.25μmol/L濃度紫杉醇聯(lián)合1.25μmol/L濃度紫草素作用于U87細胞行劃痕實驗和Transwell法觀察U87細胞遷移能力的變化。結果顯示，在藥物作用24h后，與對照組相比，紫杉醇組、紫草素組和1/2紫杉醇+1/2紫草素組分別顯著抑制了U87細胞的遷移能力。與單獨

13、應用紫杉醇、紫草素相比較，1/2紫杉醇+1/2紫草素組更顯著抑制了U87細胞的遷移力。
　　三、紫杉醇與紫草素單獨以及聯(lián)合應用抑制U87細胞侵襲
　　對照組以及4.5μmol/L紫杉醇、2.5μmol/L的紫草素及2.25μmol/L紫杉醇聯(lián)合1.25μmol/L紫草素作用于U87細胞24h后，各組穿過含BD基質(zhì)膠的Transwell小室的細胞個數(shù)分別是100±3.2個，65±2.4個，50±2.3個，27±3.3個。與對照

14、組相比，紫杉醇組、紫草素組和1/2紫杉醇+1/2紫草素組分別顯著抑制了U87細胞的侵襲能力。與單獨應用紫杉醇、紫草素相比較，1/2紫杉醇+1/2紫草素組更顯著抑制了U87細胞的侵襲力。
　　四、紫杉醇與紫草素單獨以及聯(lián)合應用促進U87細胞凋亡
　　單獨應用紫杉醇與紫草素，以及1/2紫杉醇+1/2紫草素組于U87細胞24h后，對照組、紫杉醇組、紫草素組及聯(lián)合應用組的凋亡率（含壞死細胞）分別是3.5±1.22％,28.4±2.8

15、9％，35.7±3.42％及40.6±3.76％;與對照組相比，紫杉醇組、紫草素組和1/2紫杉醇+1/2紫草素組分別顯著促進了U87細胞的凋亡。與單獨應用紫杉醇、紫草素相比較，1/2紫杉醇+1/2紫草素組更顯著促進了U87細胞的凋亡(P＜0.01）。
　　五、紫杉醇與紫草素單獨以及聯(lián)合應用對細胞周期的影響
　　對照組，紫杉醇組、紫草素組及1/2紫杉醇+1/2紫草素組的凋亡率分別是0.18±0.43％，4.59±1.98％，0

16、.54±0.80％，8.57±2.8％。同時各組G1期RNA含量分別是52.53±3.35％，24.35±2.45％，61.35±2.29％，28.73±3.24％;各組的G2期RNA含量分別是38.87±1.59％，63.73±2.62％，26.99±2.34％，57.63±3.54％;1/2紫杉醇+1/2紫草素組顯著增加了U87細胞的凋亡率，同時紫草素組G1期的RNA含量增多，紫杉醇組及1/2紫杉醇+1/2紫草素組的G2其RNA含量

17、顯著增高。
　　六、紫杉醇與紫草素單獨以及聯(lián)合應用對p-ERK表達的影響
　　單獨應用紫杉醇與紫草素以及1/2紫杉醇+1/2紫草素組于U87細胞24h后，對照組，紫杉醇組、紫草素組及1/2紫杉醇+1/2紫草素組的p-ERK/ERK的比值分別為0.62±0.07％，0.80±0.07％，0.35±0.08％，0.49±0.04％。與對照組相比，紫杉醇組p-ERK/ERK的比值顯著增高（P＜0.05），紫草素組與1/2紫杉醇+1