慢性丙型肝炎個體化治療策略及免疫調(diào)節(jié)機制的研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(hepatitis Cvirus，HCV)感染呈全球性流行，感染人數(shù)達1.8億，我國HCV抗體陽性率約為3.2％。HCV感染后50％～80％發(fā)展為慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C，CHC），感染HCV20年后，肝硬化的年發(fā)生率為10％～15％，一旦發(fā)展為肝硬化，每年肝癌的發(fā)生率為1％～7％，嚴重危害人類健康。
　　 干擾素(interferon，IFN)聯(lián)合利巴韋林(ribavirin，RBV)

2、為目前國際公認的有效抗HCV方案，標準療程(HCV基因2型、3型丙肝患者治療24周，基因1型患者治療48周)治療基因2型、3型獲得持續(xù)病毒學應答(sustained virological response，SVR)率為55％～60％，基因1型為CHC難治的因素之一，SVR率僅為38％～41％。我國HCV感染以中老年患者居多，部分患者已進展為肝硬化或合并其他系統(tǒng)疾病，而且，因為干擾素及利巴韋林治療的副作用，臨床上約有30～40％的CHC

3、患者不能耐受標準治療方案而延誤治療，導致病情的進展，因此，亟待探索適于不同人群的CHC個體化治療方案。
　　 宿主固有免疫和獲得性免疫狀態(tài)與慢性HCV感染及抗病毒治療應答相關，尤其治療前后細胞免疫功能的變化是影響治療后早期及持續(xù)病毒學應答的重要因素。外周血單核細胞及T淋巴細胞免疫分子表達水平的觀察可能有助于抗病毒治療方案的優(yōu)化，主要包括正向免疫調(diào)節(jié)因子單核細胞Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)的表達，

4、負向免疫調(diào)節(jié)因子T細胞程序性死亡受體-1(programmed death-1，PD-1)的表達以及負向免疫調(diào)節(jié)細胞調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)的比率變化。另外，T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（T cell immunoglobulin and mucindomain-3，Tim-3）/半乳糖凝集素-9(Galectin-9，Gal-9)系統(tǒng)也在HCV感染過程中發(fā)揮重要的免疫抑制作用。探明免疫分子變化趨勢

5、及其調(diào)節(jié)機制將有助于預測慢性HCV感染的抗病毒治療應答及預后。
　　 我們結(jié)合我國慢性丙型肝炎發(fā)病特點及免疫狀況，探討適于不同人群的個體化治療方案，并通過觀察治療前后細胞免疫功能的變化和體外細胞培養(yǎng)及干預實驗，明確干擾素治療前、治療中相關免疫指標變化與治療效果的關系，為CHC免疫調(diào)節(jié)療法的的研發(fā)提供理論依據(jù)。
　　 第一部分：慢性丙型肝炎個體化抗病毒方案的臨床研究
　　 目的:探討適于中國人群慢性HCV感染的個體

6、化抗病毒治療方案，改善患者依從性、提高臨床治愈率。
　　 方法:采用前瞻、開放性臨床研究，選擇2010年1月～2012年12月在河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院、石家莊市第五醫(yī)院、中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院、邢臺市人民醫(yī)院、邯鄲市傳染病醫(yī)院住院CHC患者280例，記錄患者感染途徑。根據(jù)患者年齡（＜65歲或≥65歲）、體重（＜60kg或≥60kg）、合并疾病狀態(tài)（是否有肝硬化、糖尿病、心臟疾病、甲狀腺疾病等）及患者經(jīng)濟承受能力選擇不同劑

7、量、類型干擾素聯(lián)合利巴韋林治療的個體化方案。研究包括IFNα-2b和PegIFNα-2a組，每組根據(jù)應用干擾素劑量又分為小劑量組和常規(guī)劑量組，根據(jù)治療過程中完全病毒學應答時間確定療程。對比分析不同治療方案病毒學應答率和不良反應發(fā)生情況，以及HCV基因型與病毒學應答的關系。
　　 結(jié)果:輸血/血制品感染者203例(72.5％)，30例(10.7％)為其他途徑感染包括手術/外傷、拔牙、針灸或內(nèi)鏡檢查等侵襲性操作、穿耳洞等，47例(1

8、6.8％)感染途徑不明。IFNα-2b組(n=171)快速病毒學應答(rapid virological response，RVR)、完全早期病毒學應答(complete early virological response，cEVR)、持續(xù)病毒學應答(sustained virological response，SVR)和不良反應率依次為52.0％，71.3％、57.9％和7.0％，PegIFNα-2a組(n=109)為69.7％、8

9、9.9％、74.1％和8.3％,PegIFNα-2a組RVR、cEVR率顯著高于IFNα-2b組（P＜0.01）。IFNα-2b小劑量組(n=68)RVR、cEVR、SVR和不良反應率分別為44.1％、69.1％、57.1％和10.3％，IFNα-2b常規(guī)劑量組(n=103)分別為57.3％、72.8％、60.0％和4.9％，兩組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。PegIFNα-2a小劑量組(n=48)RVR、cEVR、SVR和不

10、良反應率分別為66.7％、85.4％、68.8％和12.5％，在PegIFNα-2a常規(guī)劑量組(n=61)分別為72.1％、93.4％、81.8％和4.9％，兩組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。發(fā)生代償期肝硬化CHC患者(n=16)RVR、cEVR和不良反應發(fā)生率分別為31.3％、81.3％和6.3％，未發(fā)展為肝硬化患者(n=264)分別為60.6％、78.4％和7.6％，其RVR率顯著高于代償期肝硬化患者(P＜0.05)。14

11、6例進行HCV基因型檢測的CHC患者中，1b型占62.3％。HCV基因1型感染者RVR、cEVR和不良反應發(fā)生率分別為53.2％、71.6％和8.3％，非HCV基因1型感染者分別為86.5％、83.8％和8.1％，非HCV基因1型感染者獲得RVR率顯著高于HCV基因1型感染者(P＜0.001)。
　　 結(jié)論:根據(jù)CHC患者基線特征、合并基礎疾病情況及治療過程中病毒學應答出現(xiàn)時間制定個體化治療方案，可提高患者耐受性和依從性，獲得較

12、高病毒學應答率，改善預后。
　　 第二部分：Tregs及表達PD-1、TLRs細胞亞群與慢性HCV感染及治療應答關系的研究
　　 目的:探明CHC患者干擾素治療前、治療過程中外周血細胞不同細胞亞群免疫相關分子的表達變化及其與病毒學應答的關系。
　　 方法:選擇18～65歲CHC患者70例，IFNα-2b聯(lián)合利巴韋林(IFNα-2b/RBV)治療者37例，PegIFNα-2a聯(lián)合利巴韋林(PegIFNα-2a/RB

13、V)治療者33例，療程48～72周。另選擇性別、年齡與CHC患者匹配的健康體檢者20例作為對照組。采用流式細胞術檢測對照組及CHC患者不同治療組在治療前、治療第12、24、48周時外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞、表達PD-1的CD4+和CD8+T細胞、表達TLR2、TLR3、TLR4的CD14+單核細胞比率變化，并分析其與cEVR的關系。
　　 結(jié)果:CHC患者外周血基線Treg細胞(P＜0.05)，表達PD-

14、1CD4+T細胞(P＜0.05)、表達PD-1CD8+T細胞(P＜0.01)，表達TLR2(P＜0.05)、TLR3(P＜0.001)、TLR4(P＜0.05)CD14+單核細胞比率均顯著高于對照組;IFNα-2b/RBV或PegIFNα-2a/RBV治療12周時，Treg細胞和表達PD-1CD8+T細胞比率較基線顯著降低(P＜0.05)，治療24周時表達PD-1CD8+T細胞的比率較12周進一步下降(P＜0.05)，治療48周時，表達

15、PD-1CD4+T細胞比率較前顯著下降(P＜0.01);IFNα-2b/RBV或PegIFNα-2a/RBV治療12周時表達TLR2、TLR3、TLR4CD14+單核細胞比率較基線顯著升高(P＜0.05)，治療24、48周后降至基線水平。73.5％(25/34)的IFNα-2b/RBV治療患者獲得了cEVR;78.1％(25/32)的PegIFNα-2a/RBV治療患者獲得了cEVR。多因素分析結(jié)果顯示，基線時較低水平的表達TLR3CD

16、14+單核細胞比率為獲得cEVR的獨立預測因素(OR=2.11，95％CI:1.15-3.88，P＜0.05)。獲得cEVR的CHC患者較未獲得cEVR者在抗病毒治療前表現(xiàn)為更低水平的表達TLR3CD14+單核細胞(P＜0.05)和表達TLR4CD14+單核細胞比率(P＜0.05)，在治療12周時較未獲得cEVR者表現(xiàn)為更低水平的Treg細胞（P＜0.01）、表達PD-1CD4+T細胞(P＜0.01)和表達PD-1CD8+T細胞比率(P

17、＜0.05)。
　　 結(jié)論:基線時外周血低水平的表達TLR3CD14+單核細胞比率為CHC患者抗病毒治療獲得cEVR的預測因素;干擾素聯(lián)合利巴韋林治療可通過下調(diào)外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞、表達PD-1CD4+T細胞、CD8+T細胞比率和上調(diào)表達TLR2、TLR3、TLR4CD14+單核細胞的比率協(xié)同抗病毒作用，使患者獲得早期病毒學應答，為治療CHC提供新的免疫靶點。
　　 第三部分：Tim-3/Ga

18、l-9通路在慢性丙型肝炎病毒感染中免疫調(diào)節(jié)作用的研究
　　 目的:探明Tim-3/Gal-9通路在慢性HCV感染中的作用及其調(diào)節(jié)細胞免疫功能的機制。
　　 方法:選擇18～65歲CHC患者40例，并選擇性別、年齡匹配的健康體檢者20例作為對照組，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法檢測對照組和CHC患者治療前、治療第12、24、48周及治療結(jié)束后隨訪2

19、4周血漿Gal-9、白細胞介素-12(Interleukin-12，IL-12)水平。選擇CHC患者和健康對照各15例，分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)進行體外培養(yǎng)，給予Tim-3阻斷劑聯(lián)合TLR4激動劑脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)或TLR3激動劑聚肌胞苷酸[Polyinosinic∶polycytidylicacid,Poly(I∶C)]干

20、預。所分離PBMC分為5組:空白組（Control）:不予任何干預;TLR4激動劑組(LPS):加入LPS培養(yǎng);Tim-3阻斷劑+TLR4激動劑組(Anti-Tim-3+LPS):先加入Anti-Tim-3抗體培養(yǎng)30min后再加入LPS培養(yǎng);TLR3激動劑組[Poly(I∶C)]:加入Poly(I∶C)培養(yǎng);Tim-3阻斷劑+TLR3激動劑組[Anti-Tim-3+Poly(I∶C)]:加入Anti-Tim-3抗體培養(yǎng)30min后加入

21、Poly(I∶C)培養(yǎng)。細胞共培養(yǎng)24h，分離細胞培養(yǎng)上清液，ELISA法檢測IL-12、IFN-α和腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis factor-alpha，TNF-α)表達水平;實時熒光定量PCR檢測培養(yǎng)細胞2'-5'寡腺苷酸合成酶(2'-5'oligoadenylatesynthetase，2'-5'OAS)、粘病毒抗性蛋白A(myxovirus resistance protein A，MxA)和細胞因子信號傳導抑

22、制蛋白1(suppressor of cytokine 1，SOCS1)mRNA表達水平。
　　 結(jié)果:CHC患者血漿Gal-9水平顯著高于對照組(P＜0.05)，抗病毒治療第12、24、48周Gal-9含量均較基線水平顯著降低(P＜0.05)，治療后隨訪24周時與基線水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，治療過程中不同時間點Gal-9血漿水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);獲得cEVR與未獲得cEVR、獲得SVR與未獲得SV

23、R患者Gal-9水平差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。CHC患者基線IL-12血漿水平與對照組無顯著差異(P＞0.05)，治療12周時顯著高于對照組(P＜0.05)和基線水平(P＜0.01)，治療24、48周及治療結(jié)束后隨訪24周時與基線水平比較無顯著差異(P＞0.05);獲得cEVR與未獲得cEVR、獲得SVR與未獲得SVR患者相比，IL-12水平均無顯著差異(P＞0.05)。健康對照與CHC患者各組PBMC培養(yǎng)上清中IL-12含量

24、均較低，組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。健康對照與CHC患者培養(yǎng)細胞抗病毒因子IFN-α、2'-5'OAS及MxA表達均為干預組顯著高于空白組(P＜0.05);除Anti-Tim-3+Poly(I∶C)組外，炎癥因子TNF-α及免疫抑制因子SOCS1表達均為干預組顯著高于空白組(P＜0.05)。Anti-Tim-3+LPS組2，-5'OAS和MxAmRNA表達較單用LPS干預組顯著升高(P＜0.05)，SOCS1mRNA表達

25、則較單用LPS干預組顯著降低(P＜0.05)。Anti-Tim-3+Poly(I∶C)組IFN-α、2'-5'OAS和MxA表達均顯著高于單用Poly(I∶C)組和Anti-Tim-3+LPS組(P＜0.05)，SOCS1mRNA表達則顯著低于單用Poly(I∶C)組（P＜0.001），TNF-α在Anti-Tim-3+Poly(I∶C)組含量最低，但與其他干預組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。CHC患者與健康對照相比，Anti-

26、Tim-3+LPS組IFN-α和2'-5'OAS表達、Anti-Tim-3+Poly(I∶C)組2'-5'OAS表達均顯著低于健康對照(P＜0.05)，MxA和TNF-α在各組間比較差異無統(tǒng)計學意義，SOCS1除在Anti-Tim-3+Poly(I∶C)組差異無統(tǒng)計學意義外，其余組均顯著高于健康對照(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、慢性HCV感染患者血漿Gal-9水平顯著升高，抗病毒治療早期可提高IL-12表達