川芎嗪烴基哌嗪衍生物CXC137對NMDA誘導的SH-SY5Y細胞損傷及血管性癡呆模型大鼠保護作用研究.pdf

1、血管性癡呆是發(fā)生在腦血管基礎上的以記憶、認知功能缺損為主，或伴有語言、視空間技能及情感或人格障礙的獲得性智能持續(xù)性損害的綜合征。血管性癡呆產生原因多為腦梗塞導致腦缺血，再灌注引起的腦實質損傷。當今研究表明：興奮性氨基酸毒性、自由基損傷和神經細胞凋亡是缺血.再灌注導致的腦實質損傷進而引起血管性癡呆的主要分子生物學機制。
　　 川芎嗪是中藥川芎的主要有效成分之一，具有清除氧自由基、鈣拮抗、擴血管、抗血小板聚集和血栓形成等多種作用，廣

2、泛應用于臨床治療。但川芎嗪分子中的甲基易被氧化，生成極性和水溶性較大的代謝物而迅速被排出體外，所以川芎嗪存在半衰期短，生物利用度低等缺點。本課題選用的化合物CXC137，是以氟桂利嗪的主要藥效基團二苯甲基-1-哌嗪基甲基基團取代川芎嗪的藥代基團2位甲基而合成出的新型川芎嗪烴基哌嗪類衍生物。氟桂利嗪為第2代哌嗪類鈣拮抗藥，能通過血腦屏障，選擇性擴張血管，預防缺血、缺氧引起的細胞內Ca2+超載所致細胞損害，臨床上廣泛用于心腦血管疾病和外周血

3、管功能不全的防治。以氟桂利嗪的活性基團取代川芎嗪分子的藥代基團，以期克服川芎嗪體內半衰期短、生物利用度低等缺點，并通過協(xié)同作用增強藥效，提高抗心腦血管疾病作用。
　　 本研究第一部分以N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)作用于人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)，模擬體內興奮性氨基酸毒性造成的神經細胞損傷，第二部分采用雙側頸總動脈結扎并降壓的方法制作大鼠血管性癡呆模型。實驗目的為從不同方面探討CXC137對NMDA誘導的神經細胞損

4、傷和抗凋亡的作用機制，以及對血管性癡呆模型大鼠的藥理學作用，為進一步開發(fā)該化合物治療神經系統(tǒng)疾病提供理論基礎。同時，以傳統(tǒng)中藥的有效成分為先導化合物，在構效關系研究的基礎上對其進行結構改造和優(yōu)化，為充分利用我國豐富的天然植物資源進行創(chuàng)新藥物研究提供依據。
　　 1.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞活力的影響
　　 采用MTT法檢測細胞活力。實驗結果顯示：SH-SY5Y細胞經NMDA200μmol/L損傷后，細

5、胞活力明顯降低(P<0.01)。而溶媒組(3％oDMSO)對細胞活力無影響。同時發(fā)現(xiàn)，NMDA損傷前或損傷后給予CXC137均對細胞損傷具有保護作用(P<0.01)。
　　 2.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞LDH釋放率的影響
　　 收集氧化損傷處理后的細胞培養(yǎng)上清液和細胞裂解液，參照試劑盒說明分別測定培養(yǎng)上清液和細胞裂解液中的LDH活性，計算細胞LDH釋放率。實驗結果表明：NMDA損傷后SH-SY5Y細胞

6、LDH釋放率顯著增高(P　　 3.流式細胞術檢測細胞凋亡率
　　 細胞經處理后，以Annexin V-FITC/PI雙染后上流式細胞儀檢測。實驗結果表明，與正常組比較，模型組細胞的凋亡率明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，CXC137各濃度組細胞的凋亡率明顯降低，且呈劑量依賴性關系，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

7、>　　 4.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞內Caspase-3蛋白活性及表達的影響
　　 使用Caspase-3活力檢測試劑盒和Western Blot檢測Caspase-3活力和表達。實驗結果表明：加入NMDA后，Caspase-3蛋白活性及表達均明顯升高(P<0.01)，CXC13720、40和80μmol/L三個劑量組均可顯著降低Caspase-3活力和蛋白表達水平(P　

8、　 5.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞內游離鈣濃度的影響
　　 細胞懸液以熒光探針Fura-3/AM負載后，置多功能酶標儀檢測熒光強度，檢測波長為λem=490 nm/λex=526nm。實驗結果表明：加入NMDA損傷后細胞內鈣離子濃度升高(P<0.01)。給予20、40、80μmol/L CXC137后，細胞內鈣離子濃度均顯著降低(P<0.01)。
　　 6.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞

9、ATP含量的影響
　　 收集細胞裂解液，用考馬斯亮藍法定細胞內總蛋白量。按ATP含量檢測試劑盒說明書測定細胞ATP含量。實驗結果表明：加入NMDA后，細胞內ATP含量明顯降低(P<0.01)。給予20、40、80μmol/L CXC137后，ATP含量顯著升高(P<0.01)。
　　 7.DPPH*法測定CXC137體外清除自由基能力
　　 將不同濃度的抗氧化劑加入DPPH*后，在516nm處的紫外吸光度會發(fā)生改

10、變，用以檢測化合物清除自由基的能力。實驗結果表明：50mg/ml CXC137體外自由基清除率在40％左右，具有一定的清除自由基的能力。但清除能力不如維生素E和TMP。
　　 8.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞MDA、GSH含量，SOD活力的影響
　　 收集細胞裂解液，用考馬斯亮藍法定細胞內總蛋白量，按MDA、GSH、SOD檢測試劑盒說明書測定細胞內MDA、GSH含量、SOD活力。實驗結果表明：加入NMDA

11、后，細胞內MDA生成量顯著增高(P<0.01)。與NMDA組相比，40、80μmol/L CXC137組細胞內MDA生成量均明顯減少（P<0.01）。加入NMDA后，細胞內SOD活力和GSH含量均顯著降低（P<0.01）。與NMDA組相比,40、80μmol/L CXC137組細胞SOD活力和GSH含量均明顯升高(P<0.01)。
　　 9.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細胞內NO含量和NOS活性的影響
　　

12、收集細胞裂解液，用考馬斯亮藍法定細胞內總蛋白量，按NO、NOS檢測試劑盒說明書測定細胞內NO含量和NOS活性。實驗結果表明：SH-SY5Y細胞的NO含量，在NMDA損傷后開始升高，在加入NMDA后24h達到最高峰，隨后含量開始下降，加入80μmol/L CXC137和氟桂利嗪后，SH-SY5Y細胞的NO含量均有所下降。SH-SY5Y細胞的tNOS和iNOS的含量，在NMDA損傷后開始升高，在加入NMDA后12h達到最高峰，隨后含量開始下

13、降，在36-48h時降至正常水平；加入80μmol/L CXC137和氟桂利嗪后，SH-SY5Y細胞的tNOS和iNOS含量均有所下降。
　　 10.CXC137對血管性癡呆模型大鼠行動能力的影響
　　 前肢抓握實驗是動物實驗中常用的檢查動物行動能力的實驗方法，方法簡便、快捷。手術后第30日經行前肢抓握實驗用以檢測實驗大鼠行動能力，并進行評分結果表明：反復結扎雙側頸總動脈后，動物的行動能力有所降低，給予CXC137治療后

14、，動物行動能力有所提高。
　　 11.CXC137對血管性癡呆模型大鼠空間學習記憶能力的影響
　　 本實驗采用Morris水迷宮檢測大鼠的空間記憶能力，包括定位航行實驗和空間探索實驗兩項檢測指標。在定位航行實驗中，模型組大鼠測試成績最差，逃避潛伏期比假手術組明顯延長(p<0.01)；另外空間探索實驗中，穿越平臺次數(shù)和在平臺所在象限停留時間均顯著減少(p<0.01)，表明雙側頸總動脈結扎造成大鼠腦慢性缺血，4周后模型大鼠已

15、出現(xiàn)顯著的學習記憶能力損害，而給予80mg/kgCXC137后，大鼠定位航行實驗逃避潛伏期有所降低，空間探索實驗中，穿越平臺次數(shù)和在平臺所在象限停留時間均顯著增高(p<0.01)。
　　 12.CXC137對血管性癡呆模型大鼠腦內谷氨酸含量的影響
　　 收集實驗大鼠腦組織勻漿，用考馬斯亮藍法定細胞內總蛋白量，按谷氨酸含量檢測試劑盒說明書測定組織谷氨酸含量。實驗結果表明：雙側頸總動脈反復結扎并降壓后，大鼠腦組織勻漿中谷氨酸

16、含量明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，20、80mg/kg CXC137能夠降低腦組織中谷氨酸含量(p<0.05)。
　　 13.CXC137對血管性癡呆模型大鼠腦內MDA、GSH含量和SOD活性的影響
　　 收集實驗大鼠腦組織勻漿，用考馬斯亮藍法定細胞內總蛋白量，按MDA、GSH含量檢測試劑盒說明書測定組織MDA、GSH含量，按SOD活性檢測試劑盒說明書測定組織SOD活性。實驗結果表明：雙側頸總動脈反復結扎并降壓

17、后，大鼠腦組織勻漿中MDA含量明顯升高(P　　 14.CXC137對血管性癡呆模型大鼠腦內NO含量及NOS活性的影響
　　 收集實驗大鼠腦組織勻漿，用考馬斯亮藍法定細胞內總蛋白量，按NO含量

18、檢測試劑盒說明書測定組織NO含量，按NOS活性檢測試劑盒說明書測定組織NOS活性。實驗結果表明：雙側頸總動脈反復結扎并降壓4周后，大鼠腦組織勻漿中NO含量和NOS活性無顯著變化（無統(tǒng)計學差異）。
　　 15.CXC137對血管性癡呆模型大鼠腦內線粒體的影響
　　 線粒體懸液的渾濁度可反映線粒體腫脹度，其吸光度越高說明線粒體腫脹程度越高，線粒體損傷越嚴重。實驗結果表明：雙側頸總動脈反復結扎并降壓4周后，大鼠腦內線粒體腫脹度