維生素K2調(diào)控大鼠肝卵圓細胞SXR表達的實驗研究.pdf

1、目的：建立一種具有SXR穩(wěn)定生物學特性的大鼠肝SXR基因Nr1i2表達載體，為進一步研究SXR活化后肝細胞的生物學特性提供性的技術方法。明確維生素K2對大鼠肝卵圓細胞SXR的調(diào)控作用，以及SXR與matrilin-2之間相互關系，探討維生素K2促進HOC介導的肝再生造模大鼠施行部分肝切除術后肝再生和肝功能恢復的機制。為進一步闡明ECM在維持正常的肝臟結(jié)構、促進肝再生的作用及機制和臨床防治肝功能損害或衰竭、促進肝再生的新藥研發(fā)提供理論依據(jù)

2、。
　　 方法：⑴提取大鼠肝組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，用作PCR擴增模板；⑵將制備的cDNA為擴增模板，應用PCR技術擴增至Nr1i2編碼框區(qū)，并進行SXR基因序列測序檢測；⑶將Nr1i2片段亞克隆至pcDNA3.1(+)真核表達載體，對pcDNA3.1(+)-Nr1i2真核表達載體進行雙酶切和測序鑒定；⑷篩選出pcDNA3.1(+)-Nr1i2載體瞬時轉(zhuǎn)染293細胞系，細胞培養(yǎng)48h后進行熒光定量PCR檢測目的基因SX

3、R的mRNA表達，72h后進行Western Blot檢測SXR的蛋白表達。⑸選取大鼠肝卵圓細胞WB-F344系體外培養(yǎng)，通過Western blot的方法檢測WB-F344細胞SXR與matrilin-2蛋白表達；⑹分別用維生素K2和萊菔硫烷對大鼠肝卵圓細胞進行藥物處理，運用QPCR檢測大鼠肝卵圓細胞各處理組中SXR基因和Matrilin-2基因變化情況；⑺分析肝卵圓細胞SXR與其內(nèi)matrilin-2的表達相互關系。
　　

4、結(jié)果：①正確調(diào)取SXR(Nri12)編碼區(qū):用大鼠肝cDNA模板PCR擴增后，電泳檢測在2kb和1kb之間有單一條帶，且大小更靠近于1kb，這與SXR實際擴增大小1318bp左右相符。繼而進行測序驗證，測序結(jié)果行BLAST后發(fā)現(xiàn)其與SXR序列一致，提示SXR目的基因已成功擴增。②成功克隆SXR至真核表達載體:質(zhì)粒行雙酶切后電泳檢測，結(jié)果可見有與SXR大小一致的條帶切出（見圖2）。將此克隆進行測序驗證，測得序列與SXR序列一致，繼續(xù)將所克

5、隆片段測序，序列拼接后與NCBI上公布的SXR序列進行BLAST，結(jié)果顯示所克隆片段序列與公布的SXR序列完全一致，說明基因SXRCDS已成功克隆入至真核表達載體pcDNA3.1+中，可以用于后續(xù)過表達實驗。③SXR表達載體成功實現(xiàn)過表達:將構建好的SXR過表達載體轉(zhuǎn)染進HEK-293細胞系中，48h收集細胞進行熒光定量PCR，72h后Western Blot檢測。結(jié)果顯不SXR的mRNA和蛋白表達均明顯增加。HEK-293細胞系、PC

6、DNA-3.1+、PCDNA-3.1+-NR1I2中SXR的RT-PCR結(jié)果分別為（1.00±0.09）、（4.88±0.94）、（473274.04±28784.24），后者分別與前兩者比較，均有p＜0.01。④經(jīng)過Western blot對實驗室常用的工具細胞293細胞、U251細胞、hela細胞和WB細胞中SXR、Matrilin-2本底含量的檢測。結(jié)果顯示在293細胞、U251細胞、hela細胞和WB細胞中均能在50 kDa處檢

7、測出SXR表達，在107 kDa處檢測出Matrilin-2的表達;對Western blot檢測結(jié)果進行灰度分析，WB細胞分別與293細胞、U251細胞、hela細胞進行比較均得出p＜0.05，說明SXR、Matrilin-2在不同細胞的表達存在差異性，具有統(tǒng)計學意義。⑤WB細胞中SXRmRNA(Nr(1)i2)表達量:萊菔硫烷干預組SXRmRNA表達量最低，維生素K2干預組表達量最高，空白對照組位于兩者之間，各組差異有統(tǒng)計學意義(P

8、＜0.01)。 WB細胞中matrilin-2mRNA(Matn2)表達量:萊菔硫烷干預組表達量最低，維生素K2干預組表達量最高，空白對照組位于兩者之間，各組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。⑥通過SXR激動劑維生素K2與抑制劑萊菔硫烷分別對WB細胞干預，WB細胞SXRmRNA(Nrli2)與matrilin-2mRNA(Matn2)表達關系R的平方=0.8908，兩者呈正相關性(P＜0.01)有統(tǒng)計學意義，表明在WB細胞內(nèi)存在可以通過

9、SXR調(diào)控matrirlin-2表達的關系。
　　 結(jié)論：⑴成功建立一種具有SXR穩(wěn)定生物學特性的大鼠肝SXR基因Nr1i2表達載體，為進一步研究SXR活化后肝細胞的生物學特性提供性的技術方法;⑵證實了大鼠肝HOC本身具有SXR受體和Matrilin-2;⑶SXR對matrilin-2表達起著上調(diào)作用，兩者在統(tǒng)計學上呈正相關的關系;⑷維生素K2作為一種SXR的激活劑，對SXR起著調(diào)控作用;⑸維生素K2促進大鼠卵圓細胞增殖介導的肝