人腦膠質(zhì)瘤SEPT7基因表達(dá)、克隆及SEPT7基因抑制膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是人類最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，但對其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，目前已認(rèn)識到，膠質(zhì)瘤是一種多基因異常疾病，和人體其他部位的腫瘤一樣，膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展主要是原癌基因的激活與抑癌基因的失活并由此產(chǎn)生一系列基因異常和動態(tài)演進(jìn)的結(jié)果。因此尋找與膠質(zhì)瘤發(fā)病相關(guān)的基因，深入了解膠質(zhì)瘤的分子病理，在此基礎(chǔ)上開拓膠質(zhì)瘤治療的新策略和靶點(diǎn)，成為膠質(zhì)瘤研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重要內(nèi)容。 以往通過微陣列對膠質(zhì)瘤基因表達(dá)譜的研究表明：隔蛋白家族成員CDC10在膠質(zhì)

2、瘤中表達(dá)明顯降低，并經(jīng)小樣本膠質(zhì)瘤初步驗(yàn)證。隔蛋白家族是細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白，最早在酵母中被發(fā)現(xiàn)，這一家族蛋白因命名混亂，2002年統(tǒng)一以SEPT命名，CDC10被命名為SEPT7?；趯δz質(zhì)瘤基因表達(dá)譜的研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤中SEPT7表達(dá)降低，為此本課題首先從進(jìn)一步驗(yàn)證SEPT7在大樣本膠質(zhì)瘤中的表達(dá)著手，然后以SEPT7構(gòu)建體進(jìn)行治療膠質(zhì)瘤的體外實(shí)驗(yàn)，最后利用裸鼠荷瘤模型進(jìn)行了SEPT7構(gòu)建體治療膠質(zhì)瘤的動物實(shí)驗(yàn)研究，以期進(jìn)一步了解SEPT

3、7在膠質(zhì)瘤中的作用以及對膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展的影響。 本課題第一部分采用RT-PCR方法檢測47例膠質(zhì)瘤標(biāo)本以及4個(gè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中SEPT7的mRNA表達(dá)水平，以及免疫組化法研究了腫瘤標(biāo)本以及組織芯片中SEPT7的表達(dá)狀況，結(jié)果均顯示在膠質(zhì)瘤中SEPT7的表達(dá)水平隨腫瘤惡性程度增加而明顯降低，低惡度膠質(zhì)瘤與高惡度膠質(zhì)瘤的mRNA、蛋白表達(dá)水平有顯著差異；膠質(zhì)瘤細(xì)胞系TJ905、TJ899未檢測到SEPT7的表達(dá)，U251、TJ862細(xì)

4、胞系中SEPT7表達(dá)水平較正常組織顯著降低。為進(jìn)一步研究SEPT7對膠質(zhì)瘤的影響，構(gòu)建了SEPT7的真核表達(dá)載體。經(jīng)測序與SEPT7的cDNA序列比對，發(fā)現(xiàn)一處無義突變，提交Genebank，已被收錄，登錄號為DQ232879。 在本課題的第二部分，將SEPT7構(gòu)建體-脂質(zhì)體復(fù)合物直接轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系TJ905、U251，pcDNA3載體轉(zhuǎn)染組為空載對照。G418篩選陽性克隆并應(yīng)用RT-PCR、免疫熒光和蛋白印跡鑒定轉(zhuǎn)染成功

5、。流式細(xì)胞術(shù)i分析細(xì)胞周期，轉(zhuǎn)染SEPT7構(gòu)建體的細(xì)胞，其細(xì)胞周期分析結(jié)果為S期細(xì)胞比例(SPF)降低，G0/G1期阻滯，免疫熒光和蛋白印跡檢測細(xì)胞周期因子顯示正向調(diào)節(jié)因子CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4表達(dá)下降，負(fù)向調(diào)節(jié)因子p21、p16表達(dá)升高，MTT法和AnnexinV法評價(jià)細(xì)胞的增殖活性和凋亡，Martrigel三明治夾心法分析侵襲能力則表明轉(zhuǎn)染SEPT7構(gòu)建體的膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活性和侵襲能力明顯受到抑制，并可

6、誘發(fā)細(xì)胞凋亡。 本課題第三部分為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，將SEPT7低表達(dá)的U251細(xì)胞和SEPT7表達(dá)缺失的TJ905細(xì)胞分別采用細(xì)胞懸液接種法和瘤組織塊接種法接種于裸鼠右腿與腹腔鄰接部位皮下建立U251細(xì)胞來源的膠質(zhì)瘤移植瘤模型和TJ905細(xì)胞來源的膠質(zhì)瘤移植瘤模型，以脂質(zhì)體為介導(dǎo)給予SEPT7構(gòu)建體治療，將裸鼠分為治療組、空載組、對照組，每組10只。兩種腫瘤細(xì)胞來源的腫瘤模型的治療組，腫瘤的生長速度均明顯減慢，腫瘤體積小于對照組和空載組

7、，差異具有顯著性。并應(yīng)用組織病理學(xué)方法檢測SEPT7治療各組腫瘤標(biāo)本的SEPT7、細(xì)胞周期因子、Bcl-2、Caspase-3、MMP2、MMP9、SEPT7的表達(dá)以及TUNEL法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療組腫瘤標(biāo)本SEPT7表達(dá)明顯上調(diào)，CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4表達(dá)下降或消失，p21、p16表達(dá)上調(diào)。PCNA，MMP2、MMP9的表達(dá)均下降，Caspase-3表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)下降。治療組可見凋亡

8、細(xì)胞，而對照組和空載組幾乎沒有凋亡細(xì)胞。另取SEPT7低表達(dá)的U251細(xì)胞來源的荷瘤鼠，給予靶向SEPT7的RNA干涉片段，分為RNA干涉組、無義序列組、對照組。則RNA干涉組腫瘤生長速度與對照組和無義序列組相比有增長趨勢，這又從另一方面表明SEPT7對腫瘤生長具有抑制作用。 結(jié)論：SEPT7在膠質(zhì)瘤中表達(dá)下調(diào)，正常組織，低級別腫瘤與高級別腫瘤比較，差異均具有顯著性。SEPT7轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，可使細(xì)胞SPF降低，G0/G1期