宮頸癌輻射抵抗相關miRNAs的篩選及初步功能研究.pdf

1、背景和研究目的：
　　宮頸癌(cervical carcinoma,CC)是發(fā)展中國家女性第一高發(fā)惡性腫瘤,放射治療是宮頸癌治療的重要手段之一。然而,接受根治性放療的局部晚期宮頸癌患者仍然有30％左右出現(xiàn)腫瘤復發(fā)和轉移,導致治療失敗。其腫瘤細胞或腫瘤輻射抵抗特性可能是放療后復發(fā)或轉移的主要原因。研究表明引起腫瘤的輻射抵抗機制十分復雜,目前認為可能包括腫瘤細胞DNA損傷與修復異常、低氧環(huán)境和低氧誘導因子形成、腫瘤干細胞的存在、以及相

2、關的microRNAs產(chǎn)生等多種因素。深入研究腫瘤輻射抵抗的形成機制或分子網(wǎng)絡,對于有效改善腫瘤輻射治療質量具有重要意義。
　　microRNAs(miRNAs)是近年來研究的熱點,是真核生物體內(nèi)一種內(nèi)源性的非編碼小RNA,在體內(nèi)主要發(fā)揮基因沉默作用。大量研究顯示,miRNA和多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。已有報道顯示異常表達的miRNA與白血病、肺腺癌、乳腺癌、胰腺癌等疾病的化療抵抗、復發(fā)轉移及預后密切相關。但是,miRNA異

3、常表達與宮頸癌輻射敏感型或輻射抵抗的關系,尚有待研究闡明。本研究首先通過具有輻射敏感性差別的宮頸癌組織,篩選宮頸癌輻射抗性相關miRNAs,然后通過宮頸癌細胞培養(yǎng)和基因轉染等技術,進行miRNA的功能驗證和效應機制探討,為臨床預測宮頸癌放療預后、逆轉宮頸癌輻射抵抗、提高腫瘤治愈率提供新的思路和依據(jù)。
　　材料和方法：
　　1.選擇我科八例宮頸癌患者組織標本,三例放療后三年內(nèi)無復發(fā)轉移患者為對照組(輻射敏感組),三例局部復發(fā)、

4、兩例轉移患者為實驗組(輻射抵抗組)。采用美國 Affymetrix公司 microRNA芯片進行基因表達譜的差異性篩選,數(shù)據(jù)庫版本和圖像分析軟件分別為miRBase Release20和GenePix pro V6.0。
　　2.采用實時熒光定量RT-PCR技術對基因芯片結果進行驗證,并在宮頸癌輻射敏感及宮頸癌輻射抵抗的組織標本中,對所選差異表達miRNA表達水平進行驗證。
　　3.采用基因轉染方法,經(jīng)特異miRNA前體和抑

5、制物上調或下調HeLa及SiHa宮頸癌細胞miRNA表達水平,CCK-8、克隆形成、劃痕實驗、Transwell侵襲實驗、流式細胞術等觀察輻射后細胞增殖、侵襲能力、細胞凋亡及細胞周期變化。
　　4.采用多個生物信息網(wǎng)站對 miR-4778-3p可能調控的下游靶基因進行初步預測,查閱相關文獻,對miR-4778-3p調控輻射抵抗的可能機制進行初步探索。
　　5.研究結果采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學處理,采用獨立樣本的t檢

6、驗,P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。
　　主要結果：
　　1.通過miRNA芯片篩選,共獲得32個與宮頸癌輻射抵抗相關的差異表達miRNA分子,差異性表達均在2倍以上(p<0.05);與輻射敏感組織相比,在復發(fā)患者中發(fā)生表達上調miRNA分子共10個,表達下調9個。在遠轉患者中表達上調9個,表達下調4個。其中,miR-4778-3p在復發(fā)及轉移患者中的表達水平均明顯下調。RT-PCR結果與芯片結果具有良好一致性,結果表明miR

7、-4778-3p在復發(fā)轉移患者腫瘤組織中表達降低(p<0.01)。
　　2.使用特異性miR-4778-3p前體或抑制物轉染宮頸癌細胞系HeLa及SiHa使其表達水平升高或降低后發(fā)現(xiàn),與對照細胞相比,上調 miR-4778-3p的表達顯著抑制細胞輻射后的增殖活力、克隆形成和侵襲能力,而下調miR-4778-3p的表達水平后,宮頸癌細胞系的細胞活力顯著增加。然而,與對照組相比,改變 miR-4778-3p的表達水平,對輻照誘導的細胞

8、凋亡和細胞周期無影響。
　　3.通過生物學靶基因預測分析,初步結果顯示XRCC2、IRS2、IGF2BP2、CDH2、MEMO1、MYH7、ASH1及Slit1等靶基因可能受到miR-4778-3p的下游調控。但對于其確切調節(jié)作用和機制,需要進一步的實驗驗證。
　　初步結論：
　　1.本研究發(fā)現(xiàn)miR-4778-3p宮頸癌輻射敏感及輻射抵抗組織中表達水平有顯著差異,細胞實驗上調或下調 miR-4778-3p能夠降低或升