氟西汀對星形膠質細胞活性影響及脂多糖誘導分泌細胞因子TNF-α、IL-6的影響及其機制.pdf

1、背景和目的：
　　近年來隨著對抑郁癥研究的不斷深入，其發(fā)病機制已經(jīng)不再僅局限于單純的神經(jīng)遞質失調學說。抑郁癥患者在服用抗抑郁藥物之后，不但神經(jīng)突觸間隙間5-羥色胺（5-serotonin,5-HT）、多巴胺(dopamine，DA）及去甲腎上腺素（noradrenalin，NA）濃度會升高，而且病人體內的炎癥前細胞因子（Proinflammatorycytokines）水平也會較發(fā)病期間明顯降低。國內外大量的體內及體外研究發(fā)現(xiàn)炎癥

2、前細胞因子，諸如IL-1β、IL-6、NO及TNF-α等能夠通過影響神經(jīng)膠質細胞的活化及神經(jīng)發(fā)生、海馬區(qū)神經(jīng)元的損傷及再生修復及神經(jīng)營養(yǎng)性類因子，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Brain-derivedneurotrophicfactor，BDNF）等的生成直接或者間接的導致抑郁癥的發(fā)生。神經(jīng)膠質細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中腦細胞的重要組成部分，它們不但起到支持、營養(yǎng)神經(jīng)元的功能，而且能夠分泌上述的多種炎癥前細胞因子，這些細胞因子分布及作用廣泛，并通過

3、特殊的途徑與神、免疫、內分泌系統(tǒng)相互作用組成神經(jīng)-免疫-內分泌系統(tǒng)，在應對應激、炎癥反應等過程中起到重要作用，而應激及炎癥反應過程可能參與到抑郁癥的發(fā)病機制中。因此一些學者認為炎癥前細胞因子在抑郁癥的發(fā)病機制中起到了重要作用。
　　大量的文獻表明：抑郁癥患者體內的細胞因子如IL-1、IL-6、NO及TNF-α水平比正常人明顯升高，這些細胞因子對抑郁癥癥狀如抑郁心境、快感缺失、疲勞及睡眠障礙的發(fā)生發(fā)展起到促進作用。經(jīng)抗抑郁藥物治療后

4、，細胞因子水平較前明顯降低。通過腹腔注射脂多糖(LPS)或者經(jīng)過21天慢性不可預測性應激均可導致大鼠的行為性抑郁以及大鼠腦內細胞因子含量增加。細胞因子在腦內可作用于海馬區(qū)域抑制其神經(jīng)發(fā)生，而海馬區(qū)神經(jīng)發(fā)生減少也參與了抑郁癥的發(fā)病機制。注射抗抑郁藥物后可對抗這種作用。在細胞水平，大鼠腦膠質細胞系體外培養(yǎng)經(jīng)過LPS或者IFN-γ等刺激后其分泌細胞因子水平明顯升高，給予抗抑郁藥物可以明顯抑制膠質細胞系的活化增殖，而且減少了細胞因子分泌。

5、>　　本實驗通過觀察氟西汀對大鼠星形膠質細胞活性的影響及其對脂多糖刺激的星形膠質細胞對IL-6及TNF-α分泌作用的影響，來驗證抗抑郁藥對大鼠膠質細胞系細胞因子分泌存在抑制作用，從側面驗證細胞因子在抑郁癥中的作用并探討藥物作用機制。
　　材料和方法：
　　1、實驗設計
　　1.1氟西汀對星形膠質細胞活性的影響
　　星形膠質細胞按照一定細胞濃度接種到96孔板中，利用（0,1,5,10,20,40,60）μΜ氟西汀孵

6、育細胞24h、48h、72h。利用MTT法觀察各濃度、時間細胞活性的變化。
　　1.2氟西汀對LPS誘導的星形膠質細胞分泌細胞因子的影響
　　將一定細胞濃度的星形膠質細胞接種到48孔板，分為對照組、LPS組及氟西汀組，氟西汀組經(jīng)過（5,10,20,40）μΜ氟西汀預處理24h后，氟西汀組和LPS組同時經(jīng)1μ/g/ml的LPS刺激24h，對照組加入同體積稀釋液。24h后收集上清液，用Elisa法測上清液中細胞因子含量。

7、　　1.3星形膠質細胞分泌IL-6的通路機制研究
　　將一定細胞濃度的星形膠質細胞接種到48孔板，分為對照組、LPS組、PDTC組，氟西汀+PDTC組。PDTC組經(jīng)過（50,100,150,200）μΜPDTC預處理24h后氟西汀+PDTC組經(jīng)過相應濃度的氟西汀和PDTC預處理24h，PDTC組、氟西汀+PDTC組和LPS組同時經(jīng)1μ/g/ml的LPS刺激24h，對照組加入同體積稀釋液。24h后收集上清液，用Elisa法測上清液中

8、細胞因子含量。
　　2、星形膠質細胞的培養(yǎng)、純化和鑒定
　　2.1原代星形膠質細胞的培養(yǎng)
　　取24-48h內新生SD鼠4只，酒精消毒后斷頭取腦，打開顱骨，剝離腦膜，去掉嗅球，分離大腦皮層，放入2mlDMEM/F12培養(yǎng)基中，用無菌吸管機械吹打約200次，制備神經(jīng)膠質細胞混懸液。經(jīng)200目鋼網(wǎng)過濾至無菌培養(yǎng)皿中以去除組織碎塊，將過濾后的神經(jīng)膠質細胞混懸液轉移至無菌細胞培養(yǎng)箱30min去除成纖維細胞，再將去除纖維細胞的神

9、經(jīng)膠質細胞混懸液轉移至無菌細胞培養(yǎng)瓶，加入含10％FBS的DMEM/F12，放入細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24h后首次換液，此后每隔2-3d換液，培養(yǎng)約21d，星形膠質細胞和小膠質細胞均可成熟。
　　2.2星形膠質細胞的分離純化和鑒定
　　混合膠質細胞在培養(yǎng)21d后，用1：4胰酶將星形膠質細胞與小膠質細胞初步分離，定軌搖床法純化星形膠質細胞，行GFAP免疫熒光檢測，鑒定并估算星形膠質細胞純度。
　　3、MTT法檢測星形膠質細胞的

10、活性
　　分別用濃度為0μΜ、1μΜ、5μΜ、10μΜ、20μΜ、40μΜ、60μΜ的氟西汀孵育星形膠質細胞24h、48h、72h，用MTT法檢測不同氟西汀濃度及時間星形膠質細胞的活性。
　　4、IL-6及TNF-α檢測
　　純化的星形膠質細胞按照2×104或1×105接種到48孔板中，經(jīng)過（5、10、20、40）μΜ的氟西汀、（50、100、150、200）μΜ的PDTC處理后再用經(jīng)過1μg/ml的LPS刺激，收集細

11、胞上清液，用ELISA試劑盒檢測星形膠質細胞IL-6及TNF-α的分泌情況。
　　5、統(tǒng)計方法
　　應用Excell2003和SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。結果以均數(shù)±標準差（x±S）表示，采用方差分析進行比較，兩兩比較采用LSD法，方差不齊時采用DunnettT3檢驗。以P≤0.05為差異具有顯著性，P≤0.01為差異具有高度顯著性。
　　結果：
　　1.星形膠質細胞的培養(yǎng)、分離、純化及鑒定
　　

12、星形膠質細胞在培養(yǎng)24h之后就有部分細胞貼壁，24h之后經(jīng)過第一次更換細胞培養(yǎng)液（簡稱換液），去除沒有貼壁的細胞及殘留的組織碎片，此后每隔2-3d換液，在經(jīng)過21d后星形膠質細胞已經(jīng)成熟。星形膠質細胞經(jīng)過胰酶初步消化分離后，GFAP細胞免疫熒光結果顯示，陽性細胞率僅在75%以上。經(jīng)過定規(guī)搖床法進一步純化星形膠質細胞，顯微鏡下觀察，細胞貼壁生長良好，形態(tài)正常，可見星形膠質細胞的細胞突起較明顯，長短不一，細胞質豐富，胞內呈卵圓形的細胞核清晰

13、可見。星形膠質細胞經(jīng)GFAP免疫熒光染色后，熒光顯微鏡下觀察：陽性星形膠質細胞發(fā)射出綠色熒光，計數(shù)陽性細胞純度在95%以上。結果表明，定軌搖床法可以得到高純度的星形膠質細胞，其純度至少為95%，為下一步的實驗過程提供了純度較高的星形膠質細胞。
　　2.氟西汀對體外培養(yǎng)大鼠星形膠質細胞活性的影響及LPS誘導細胞對TNF-α及IL-6分泌的影響及其作用機制
　　2.1氟西汀對體外培養(yǎng)星形膠質細胞活性的影響
　　相關研究已經(jīng)

14、發(fā)現(xiàn)抗抑郁藥物能夠促進大腦神經(jīng)元的神經(jīng)發(fā)生，減少炎性細胞因子對神經(jīng)元的損害，星形膠質細胞為神經(jīng)膠質細胞中數(shù)量龐大的一種細胞，炎性細胞因子及自身分泌的細胞因子對其的損害更是相當?shù)膹V泛。本實驗中直接加入不同濃度的氟西汀分別刺激24h、48h及72h，觀察不同氟西汀濃度及時間對星形膠質細胞活性的影響。
　　2.1.1相同時間不同濃度氟西汀刺激對星形膠質細胞活性的影響
　　氟西汀濃度為（0，1，5，10，20，40，60）μΜ分別孵

15、育星形膠質細胞24h、48h及72h，MTT法檢測星形膠質細胞的活性。結果顯示：氟西汀孵育星形膠質細胞24h后，氟西汀濃度為（20，40，60）μΜ時其OD值為（0.2291±0.01383，0.2447±0.01155,0.2714±0.01631），對照組OD值為（0.1979±0.01697），與對照組相比，差異具有顯著性（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）；氟西汀孵育星形膠質細胞48h后，氟西汀濃度為60μΜ時OD值（0

16、.0329±0.00150）與對照組（0.2746±0.02443）及其它各組相比，差異具有高度顯著性（P＜0.01），其他濃度組與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義；氟西汀孵育星形膠質細胞72h后，OD值在濃度為（10，20，40）μΜ時（0.3553±0.01176,0.3480±0.00851,0.3167±0.00973）與對照組（0.2421±0.02311）及氟西汀濃度為60μΜ（0.0619±0.00521）相比差異具有顯著性（P

17、＜0.05，P＜0.01），OD值在氟西汀濃度為60μΜ時與對照組相比，差異具有高度顯著性（P＜0.01）。
　　2.1.2、相同氟西汀濃度不同時間刺激對星形膠質細胞活性的影響
　　氟西汀孵育24h、48h及72h后，氟西汀濃度為1μΜ時：其OD值分別為（0.1943±0.0106）、（0.2920±0.01483）及（0.3029±0.04246），48h、72h與24h相比，差異具有顯著性（P＜0.05）；氟西汀濃度為5

18、μΜ時：其OD值分別為（0.2095±0.02023）、（0.2850±0.00696）、（0.3144±0.00268），各組之間差異具有顯著性（P＜0.05）；氟西汀濃度為10μΜ時：其OD值分別為:（0.2131±0.01724）、（0.2938±0.01413）、（0.3553±0.91176），各組之間差異具有顯著性（P＜0.05）；氟西汀濃度為20μΜ時：其OD值分別為（0.2291±0.01383）、（0.2967±0.0

19、2622）、（0.3480±0.00851），各組之間差異具有顯著性（P＜0.05）；氟西汀濃度為40μΜ時：其OD值分別為（0.2447±0.01155）、（0.2679±0.01989）、（0.3167±0.00973），72h與24h、48h之間比較差異具有顯著性（P＜0.05），24h與48h比較差異不具有顯著性（P>0.05）；氟西汀濃度為60μΜ時：其OD值分別為（0.2714±0.01631）、（0.0329±0.0015

20、0）、（0.0619±0.00521），各組之間差異具有顯著性（P＜0.05）；
　　綜上，氟西汀在一定的濃度及時間范圍內對星形膠質細胞增殖活性大致呈現(xiàn)劑量-時間依賴性，隨著濃度及時間的增加，氟西汀促進星形膠質細胞的增殖活性，但是當氟西汀濃度達到60μΜ孵育星形膠質細胞48h或者72h，星形膠質細胞的活性明顯下降，可能是此濃度培養(yǎng)達48h或者72h后，對星形膠質細胞起到毒性負作用。
　　2.2.氟西汀對LPS誘導的星形膠質細

21、胞分泌TNF-α及IL-6的影響及其機制
　　2.2.1脂多糖對大鼠星形膠質細胞分泌TNF-α及IL-6的誘導作用
　　將純化的星形膠質細胞按照2×104細胞/孔或1×105細胞/孔細胞密度接種到48孔板中，分為對照組和LPS刺激組，LPS刺激組用1μg/ml的LPS刺激星形膠質細胞，對照組加入相同體積的LPS稀釋液（含10%FBSDMEM/F12），孵育24小時后收集上清液，進行Elisa法檢測上清液中TNF-α及IL-6