散結抗瘤方對S180荷瘤小鼠抑瘤作用和抗血管生成的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 21世紀初,惡性腫瘤仍是危害人類健康最嚴重的一類疾病。在人類死亡病因中,癌癥位居第一,并且其發(fā)病率仍在上升。據世界衛(wèi)生組織(WHO)報道,全世界每年約有1000萬人死于惡性腫瘤,不僅惡性腫瘤的發(fā)病率在上升,而且在發(fā)病年齡上日趨年輕化。如何有效的預防和治療癌癥,成為醫(yī)學界關注的重要課題之一。
　　 抗腫瘤藥物的研究一直是醫(yī)學研究的熱點,藥物的作用機制主要包括:1、誘導腫瘤細胞凋亡；2、細胞毒作用；3、抑制

2、腫瘤細胞的增殖；4、抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移等。自從八十年代初Folkman提出腫瘤生長依賴新血管生成的理論,阻斷腫瘤血管生成、切斷腫瘤組織獲得營養(yǎng)途徑已經成為新的抗腫瘤治療靶點,而且也成為抗腫瘤治療中熱門的研究內容。目前已證實的血管生成調控因子,可分為血管生成因子和血管生成抑制因子兩類。而血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作為一種誘導血管形成的血管生長因子,在血管生成過程

3、中起核心作用。
　　 在惡性腫瘤的病理中,細胞對低氧的適應和血管生成是腫瘤發(fā)展過程中的關鍵步驟之一。缺氧誘導因子-1a(hypoxia inducible factor-1a,HIF-1a)是廣泛存在于哺乳動物和人體內的一種轉錄因子,是主要的氧調節(jié)亞基和功能亞基,在腫瘤的氧反應過程中HIF-1a起著中樞紐帶的作用。促血管生成因子中最重要的是VEGF,能增加血管的通透性,促進內皮細胞的遷移、增生和腫瘤新生血管的生成,促進腫瘤的生長

4、和侵襲、轉移。國內外研究表明,VEGF通過旁分泌和自分泌機制從而促血管生成、促進腫瘤細胞生長侵潤和轉移,其在大多數(shù)腫瘤細胞內呈高表達。已有的研究表明,隨著腫瘤體積的不斷快速增大,腫瘤便進入了缺氧狀態(tài),從而使大量HIF-1a積聚。增多的HIF-1a就會與其下游攜帶有低氧反應元件(HRE)特異區(qū)域的靶基因結合使其表達增強,其中VEGF就是其靶基因中最重要的一種因子。因此,對于“HIF-VEGF-血管生成”途徑的研究,具有十分重要的意義。

5、r>　　 在祖國醫(yī)學理論中,癌病是多種惡性腫瘤的總稱。癌病的發(fā)生是在臟腑陰陽氣血失調的基礎上,六淫邪毒入侵,并與氣、痰、濕、瘀、熱等搏結積聚而成。中藥治療腫瘤有多種不同的治則。行氣化痰、活血化瘀、清熱解毒、補益氣血、利水滲濕等類中藥均具有不同程度的抑癌作用。而今隨著分子生物學技術的發(fā)展及中醫(yī)現(xiàn)代化的進展,中藥單體和復方在抗腫瘤血管生成的實驗研究中取得了長足的進展,如姜黃、川芎、全蝎、壁虎、鱉甲煎丸、參麥注射液、當歸補血湯等均已證明具有

6、很好的抑制血管生長的作用。散結抗瘤方是導師陳達理教授根據多年的臨床實踐,總結出來的中藥抗癌復方,我們臨床上觀察到它對各種實體瘤具有良好的療效,且先前的實驗研究已經證明:該方抑瘤作用可能與其誘導腫瘤細胞凋亡密切相關。散結抗瘤方以消癮化積、軟堅散結、以毒攻毒為主要功效,由浙貝、法夏、蜈蚣、夏枯草、白花蛇舌草等8味藥組成。關于這類藥的抗腫瘤作用已有很多文獻報道。本實驗以S180移植性肉瘤小鼠為研究對象,觀察該復方對VEGF和HIF-1a表達的

7、調控,探求該方抑制腫瘤血管生成的可能作用靶點。
　　 在中醫(yī)藥抗腫瘤的體內實驗研究中,建立惡性腫瘤動物模型一般來說分為三種:自發(fā)腫瘤模型、誘發(fā)腫瘤模型和移植腫瘤模型。移植腫瘤模型是目前研究最多的腫瘤模型,容易人為操作,動物成瘤穩(wěn)定,均一性好,發(fā)病率高,成瘤時間差異不大,容易施加干擾因素等。該模型不能用于病因學、癌前病變和癌變的研究,但對成瘤、治療、浸潤和轉移等研究非常有用。本實驗選用S180可移植性腫瘤細胞株,成功造成移植腫瘤模

8、型。目前此模型已廣泛的應用于腫瘤基礎研究及藥物篩選,成為研究中醫(yī)藥抗腫瘤的作用及機制的一個公認的腫瘤模型。
　　 研究目的：
　　 觀察散結抗瘤方對S180荷瘤小鼠的抑瘤作用及對免疫器官的影響,并通過免疫組化方法檢測VEGF、HIF-1a的表達,來探討其抗血管生成作用的機制,為臨床應用提供基礎的實驗依據。
　　 研究方法
　　 建立小鼠移植S180肉瘤模型:體外復蘇培養(yǎng)S180細胞,在細胞的指數(shù)生長期收集

9、細胞,用無菌生理鹽水稀釋,調整到2～3×106/ml。隨機選取10只健康SPF級昆明小鼠,每只用上述細胞懸液0.4ml腹腔注射,約1周后接種小鼠腹部明顯漲大、凸出,將小鼠頸椎脫臼處死,超凈臺內無菌抽取乳白色腹水液,用生理鹽水稀釋,調整細胞數(shù)為1～2×107/ml,取0.2ml于每只小鼠右上肢腋窩消毒后皮下接種。瘤細胞懸液接種前,均用0.2％臺盼藍染色,計算活細胞數(shù)為95％～98％。從抽取腹水開始,到接種完最后1只小鼠的總時間控制在1h內

10、。
　　 隨機將接種后的小鼠分為荷瘤對照組、環(huán)磷酰胺(CTX)組、散結抗瘤方組、散結抗瘤方加CTX組(聯(lián)合組)。每組10只。荷瘤對照組給予蒸餾水0.5ml灌胃,生理鹽水0.2ml腹腔注射；環(huán)磷酰胺組給予蒸餾水0.5ml灌胃,環(huán)磷酰胺20 mg/kg腹腔注射；散結抗瘤方組(根據人與小鼠藥物劑量換算公式計算)相應劑量灌胃,生理鹽水0.2ml腹腔注射；散結抗瘤方加CTX組(聯(lián)合組)散結方藥液相應劑量灌胃,環(huán)磷酰胺20mg/kg腹腔注射

11、。實驗過程中每3天稱1次體重,根據體重計算相應的給藥量。用藥后注意觀察動物的一般情況。各組連續(xù)給藥15天。停藥次日稱重并處死小鼠,解剖剝離瘤塊,稱重計算均值,計算腫瘤抑制率；同時取出小鼠的脾臟和胸腺,稱其重量,計算脾臟、胸腺指數(shù)。腫瘤組織用10％中性甲醛固定,梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋切片,HE染色,光鏡觀察腫瘤組織的病理改變。采用免疫組化SP法檢測各組荷瘤小鼠腫瘤組織的VEGF、HIF-1a的表達強度。
　　 研究結果

12、
　　 1、荷瘤對照組腫瘤生長較快,并且小鼠飲食減少,毛發(fā)雜亂無光澤,豎毛現(xiàn)象明顯；其他各組腫瘤生長相對緩慢,散結抗瘤方組和聯(lián)合組小鼠明顯比荷瘤對照小鼠活潑,皮毛有光澤,豎毛現(xiàn)象不明顯；環(huán)磷酰胺組小鼠狀況最差。
　　 2、散結抗瘤方、環(huán)磷酰胺組、聯(lián)合組的瘤重與荷瘤對照組相比差異顯著(F=52.692,P=0.000)；且聯(lián)合組的瘤重明顯低于散結抗瘤方組和環(huán)磷酰胺組(P<0.05)。單獨應用散結抗瘤方和環(huán)磷酰胺的抑瘤率分別

13、為30.26％和51.55％,而在相同條件下,聯(lián)合用藥組抑瘤率為71.14％,按照金氏公式求的q值為1.08,表明兩藥聯(lián)合應用具有協(xié)同作用。
　　 3、散結抗瘤方組的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)較荷瘤對照組和環(huán)磷酰胺組有顯著性提高,差別具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與環(huán)磷酰胺組比較,聯(lián)合組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均有顯著性提高(P<0.05)。
　　 4、HE染色切片可見:荷瘤對照組腫瘤細胞排列較密集,瘤組織內小血管較豐富。各給藥組

14、均可見不同程度的片狀壞死區(qū),瘤組織及其周圍新生微血管減少,其中以聯(lián)合組最為顯著。
　　 5、各組小鼠腫瘤組織中VEGF和HIF-1a蛋白的表達:與荷瘤對照組比較,其余實驗各組的VEGF、HIF-1a蛋白的表達均明顯降低(F=54.982,P=0.000；F=88.759,P=0.000)。與散結抗瘤方組比較,環(huán)磷酰胺組的VEGF和HIF-1a的表達顯著降低(P<0.05)。
　　 6、HIF-1a與VEGF表達的相關性:

15、Spearman等級相關分析結果顯示,HIF-1a的表達與VEGF表達之間呈正相關(r=0.806,P=0.000)。
　　 研究結論
　　 散結抗瘤方可以改善荷瘤小鼠的生存狀態(tài)；同時可以抑制腫瘤生長,且與CTX有協(xié)同作用。散結抗瘤方有減除腫瘤對宿主免疫器官的損害和抑制作用,且可提高宿主的免疫功能。散結抗瘤方可以抑制小鼠腫瘤組織的VEGF、HIF-1a的表達,且HIF-1a和VEGF之間正相關,由此提示HIF-1a可能參