移植肝膽管細胞膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白在膽管損傷中的作用實驗研究.pdf

1、一、研究背景
　　 膽道并發(fā)癥仍然是嚴重影響肝移植受者生活質(zhì)量及長期生存率的并發(fā)癥之一。隨著外科技術(shù)的進步,吻合口狹窄等并發(fā)癥呈逐漸下降的趨勢,而非吻合口并發(fā)癥,如缺血型膽道病變,則成為肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的主要臨床病理表現(xiàn)。
　　 肝臟移植術(shù)后缺血型膽道病變的發(fā)生機制尚不明確,目前,學者普遍認為與膽道缺血、免疫等因素有關(guān)。近年來,越來越多的研究表明膽汁中膽鹽/磷脂比升高在肝移植后膽管損傷中起著重要作用。然而,肝移植后膽

2、鹽/磷脂比升高引起膽管及其上皮細胞損傷的具體機制尚無研究報道。研究表明,膽鹽除了有“去污作用”外,還可在細胞內(nèi)發(fā)揮信號分子的作用,參與細胞的增生和凋亡;而且由于其“去污作用”需要在高濃度下才能發(fā)揮,所以膽鹽以信號分子的角色參與膽管細胞的病理生理改變可能更為普遍。在生理情況下,膽管細胞可經(jīng)頂膜鈉依賴性膽汁酸轉(zhuǎn)運體(apicalsodium-dependent bile acid transporter,ASBT)進行膽汁酸的重吸收,由細胞

3、內(nèi)膽汁酸結(jié)合蛋白(ileal bile acid binding protein,IBABP)轉(zhuǎn)運至細胞基底側(cè),并經(jīng)有機溶質(zhì)轉(zhuǎn)運體α/β(organic solute transporter alpha/beta,Ostα/β)等轉(zhuǎn)出至門脈系統(tǒng),從而啟動了膽汁酸的“膽肝循環(huán)”。平衡的“膽肝循環(huán)”不會引起膽鹽在細胞內(nèi)潴留,這也是膽管細胞對膽鹽毒性的一種自我保護機制。研究表明在多種炎癥性及代謝性疾病中,膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白表達發(fā)生改變,引起膽汁酸

4、轉(zhuǎn)運的紊亂,從而參與了疾病的發(fā)生發(fā)展。據(jù)以上觀點和現(xiàn)象,我們推測,在移植肝冷保存再灌注損傷時,由于炎癥因子的作用及核受體(如類法尼醇受體)表達/功能的改變,膽管細胞的膽汁酸轉(zhuǎn)運平衡可能受到破壞,導(dǎo)致膽管細胞對膽鹽毒性的自我保護功能紊亂,膽鹽在膽管細胞內(nèi)聚集,從而引起膽管細胞的損傷。
　　 二、研究目的
　　 基于以上假設(shè),本研究以同系大鼠肝移植模型為研究對象,探討移植肝膽管細胞膽鹽轉(zhuǎn)運蛋白在膽管損傷中的作用,并利用體外培

5、養(yǎng)的膽管研究類法尼醇受體(Farnesoid X receptor,FXR)對膽管細胞膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白表達的影響,探討肝移植后膽管細胞膽鹽轉(zhuǎn)運蛋白參與膽管細胞損傷的機制。
　　 三、研究方法及結(jié)果
　　 1.利用免疫組織化學檢測肝組織中ASBT、IBABP、Ostα及Ostβ的表達分布,結(jié)果顯示,ASBT表達于大膽管細胞頂側(cè)胞膜,IBABP表達于大膽管細胞漿,Ostα/Ostβ異二聚體表達于大、小膽管細胞基底側(cè)胞膜及肝細胞

6、血竇面胞膜。同時,我們用Realtime PCR及Western blot方法檢測分離的大小膽管組織中ASBT、IBABP及Ostα/Ostβ的表達,結(jié)果也顯示,大膽管組織中ASBT和IBABP的表達顯著高于小膽管,而Ostα/Ostβ在大膽管和小膽管組織中的表達量無顯著差異。
　　 2.我們從mRNA水平和蛋白水平檢測了移植肝膽管細胞膽鹽轉(zhuǎn)運蛋白的表達變化,并通過組織形態(tài)學觀察和細胞凋亡檢測評估移植肝膽管損傷的嚴重程度,結(jié)果顯

7、示,大鼠肝移植術(shù)后早期(術(shù)后1-3天)膽管細胞膽鹽轉(zhuǎn)運蛋白的表達均降低,降低幅度與供肝冷保存時間相關(guān)。隨后,位于細胞頂側(cè)的ASBT與位于胞漿內(nèi)的IBABP及基底側(cè)Ostα-Ostβ呈現(xiàn)不同的恢復(fù)速度及變化趨勢,即ASBT很快恢復(fù)到正常水平,且在術(shù)后第7天其表達水平顯著高于正常,而IBABP和Ostα-Ostβ表達長時間降低,直到術(shù)后第7天(短冷卻血組)甚至到第14天(長冷缺血組)才恢復(fù)到正常水平。ASBT與IBABP、Ostα和Osβ表

8、達水平的比值與大膽管損傷嚴重程度顯著相關(guān)。
　　 3.在檢測移植肝膽汁中膽汁酸和磷脂濃度變化情況的基礎(chǔ)上,我們通過免疫組織化學、熒光實時定量PCR、Western blotting及電泳移動漂移實驗等技術(shù),探討不同冷保存時間下移植肝FXR表達及功能變化,結(jié)果顯示,供肝冷保存再灌注損傷并不能引起膽汁中總膽汁酸的濃度的改變,只是通過降低磷脂的濃度,使膽汁酸/磷脂比增加,從而升高了膽汁中膽汁酸的相對濃度。大鼠肝移植后膽管組織中FXR的

9、表達及功能活性顯著降低,供肝冷保存時間越長,降低越明顯。
　　 4.通過分離培養(yǎng)SD大鼠肝內(nèi)膽管,探討FXR對與膽汁共培養(yǎng)的膽管細胞之膽鹽轉(zhuǎn)運蛋白表達的影響,結(jié)果顯示,在正常膽管上皮細胞中,毒性膽汁可促進ASBT、IBABP、Ostα及Ostβ的表達均增加;而在轉(zhuǎn)染了FXR shRNA的膽管細胞中,毒性膽汁可同樣升高ASBT的表達,而IBABP、Ostα和Ostβ的表達并未增加,反而下降。
　　 四、結(jié)論