紅花黃色素對雞趾屈肌腱損傷修復影響的實驗證實.pdf

1、目的：
　　 肌腱損傷是手外科學多發(fā)性外傷，肌腱修復術后常常形成限制性粘連，嚴重影響手部功能的恢復，迄今為止尚無一種完全行之有效的防治措施。病理學研究顯示肌腱及其周圍相關組織均參與此損傷修復過程；即所謂內(nèi)源性愈合和外源性愈合。本實驗研究借助Leghorn雞屈趾肌腱損傷修復模型、體視學觀察、生物力學檢測、病灶區(qū)堿性成纖維細胞生長因子(BFGF)，和Ⅰ型膠原蛋白免疫組化探察等方法，研究證實肌腱損傷修復過程中局部病理學變化及其變化規(guī)律

2、；局部炎癥反應、BFGF和Ⅰ型膠原蛋白對肌腱損傷修復的影響；紅花黃色素在病灶區(qū)炎癥反應、BFGF和Ⅰ型膠原蛋白的表達以及肌腱愈合過程中的作用。以此探討紅花黃色素在肌腱損傷后修復過程中的臨床作用及其作用機制。
　　 方法和材料：
　　 1.實驗對象：
　　 選用同批孵出、在相同自然條件下喂養(yǎng)的3月齡的健康雄性白色Leghorn雞56只，體重1.1～1.3kg(平均1.23±0.068kg)。假手術組雙側雞爪第3趾切

3、開皮膚后逐層進入暴露趾深屈肌腱，但不對肌腱做任何處理，然后逐層縫合。實驗組所有Leghorn雞制備雙側雞爪第3趾趾深屈肌腱橫斷后修復模型，方法和標準見[2]。
　　 2.實驗方法
　　 (1)模型構建：對雙側雞爪第3趾趾深屈肌腱手術橫斷，之后再行外科縫合，術后使用石膏固定使其呈拳擊手套狀，實驗動物隨后回籠飼養(yǎng)，并使其能夠自由活動。術后3天以含土霉素雞飼料喂養(yǎng)，旨在預防感染。
　　 (2)體視學和組織病理學檢測：分

4、別于術后1、2、4、6周進行取材，期間行體視學觀察；包括大體觀察雞趾深屈肌腱吻合口肉芽組織增生情況、肌腱愈合情況和肌腱周圍粘連的情況，并對肌腱與周圍組織粘連進行評級，以評估其粘連程度，方法及標準見[3]。組織學探察；HE染色之后在光鏡下觀察肌腱細胞爬行、細胞形態(tài)、炎性細胞浸潤、膠原纖維生成及排列情況。
　　 (3)生物力學檢測：將不同修復時間組的樣本(肌腱)由近端至止點從腱鞘內(nèi)小心銳性游離出來，然后固定于生物力學檢測儀上進行抗張

5、力測試，詳盡方法、技術和原理見[2]。
　　 (4)免疫組化檢測：本實驗主要采用免疫組織化學PAP方法；即將Rabbit anti-chicken collagen-Ⅰ和Mouse anti-bFGF抗體在4℃孵育48～72小時；然后分別進行抗兔和抗小鼠IgG(1∶100)室溫孵育2小時；最后分別進行兔-PAP和小鼠-PAP(1∶200)室溫孵育2小時；DAB-H2O2顯色。
　　 (5)數(shù)據(jù)收集和統(tǒng)計學處理
　　

6、 肌腱粘連程度的評估按照湯錦波[2]論文粘連分度法，而且對于所得數(shù)據(jù)專門使用Mann Whitney U檢驗(兩組)和H檢驗(多組)。但組織化學(HE)和免疫組化染色的陽性結構則是借助于IPPS15.0圖像分析系統(tǒng)在光鏡高倍視野(×400)下獲得實驗數(shù)據(jù)(用均數(shù)±標準差表示)，并對所獲得數(shù)據(jù)使用SPSS10.0 for windows統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理，它們兩組間比較使用t檢驗，以P＜0.05作為具有統(tǒng)計學意義，多組間比較則使用

7、方差分析ANOVA檢驗，P＜0.05表明具有統(tǒng)計學差異。
　　 實驗結果：
　　 (1)病灶區(qū)組織病理學變化
　　 觀察顯示正常組肌腱完整光滑、腱鞘內(nèi)可見淡黃色滑液、肌腱與腱周組織無粘連、肌腱滑動性良好。在假手術組呈現(xiàn)輕度的粘連，但易分離，而且肌腱滑動性能基本良好。
　　 實驗組肉眼觀察顯示，在術后1周組病灶區(qū)肌腱愈合處及其周圍組織存在明顯的水腫、粘連、肉芽組織增生。上述變化在術后2周組雖然水腫稍有減輕，

8、但肉芽組織增生加重，周圍組織的粘連情況顯示其形成于術后1周，并于損傷2周時加重。術后4-6周，病灶區(qū)水腫減退、肉芽組織疤痕化、但粘連程度變化不明顯。對所獲得的實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計結果顯示損傷1周時間組肌腱粘連程度明顯低于2-6周時間組(P＜0.05)，但在損傷2-6時間組之間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)之間。組化染色(HE)顯示在吻合口處存在大量炎性細胞浸潤或聚集，其數(shù)量與損傷修復時間和病灶區(qū)病理學變化基本一致；即在損傷1-2周時間組，炎性細

9、胞的數(shù)量最多，隨后其數(shù)量逐漸減少。
　　 (2)損傷肌腱修復的抗張力強度變化及其規(guī)律
　　 實驗設計以生物力學原理檢測損傷肌腱修復過程中的抗張力強度變化。所獲得的實驗數(shù)據(jù)顯示實驗組與對照組之間抗張力強度具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。但不同時間的實驗組之間的抗張力強度從術后1-6周，顯示逐漸增強趨勢，術后6周抗張力強度達到最高，與其它實驗組相比具有明顯的統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，但仍未恢復到正常水平，與正常之間仍有統(tǒng)計

10、學意義(P＜0.01)。
　　 (3)肌腱細胞在肌腱損傷修復過程中的形態(tài)學變化
　　 肌腱細胞包括成纖維細胞和腱細胞兩類，兩者在不同病理和機能狀態(tài)顯示不同的形態(tài)，并相互轉換。正常肌腱組織的組織化學(HE)染色顯示成纖維細胞核呈梭形，細胞呈纖維狀排列整齊，密度適中。而腱細胞核染色較深呈圓塊狀，胞體為不規(guī)則形或卵圓形。在肌腱損傷的各實驗組，兩者在組化染色中難以區(qū)分。所以，在此文我們統(tǒng)稱為肌腱細胞。
　　 光鏡觀察顯示

11、肌腱細胞在病灶區(qū)其核和胞質染色加深、體積增大，表現(xiàn)為增生肥大樣外觀。肌腱細胞的計數(shù)資料顯示，肌腱細胞在損傷1周其數(shù)量開始增加，到2周時達到高峰，之后逐漸下降，統(tǒng)計結果顯示肌腱細胞數(shù)量的變化在各實驗組之間比較具有顯著差異(P＜0.01)。與對照組比較結果顯示，在損傷1-4周實驗組均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，但在損傷6周組肌腱細胞數(shù)量接近對照組(P＞0.05)。
　　 (4)病灶區(qū)BFGF和Ⅰ型膠原蛋白表達的變化
　　

12、 BFGF在肌腱組織主要表達于損傷組織中的成纖維細胞、腱細胞和局部炎癥細胞。我們的免疫組織化學探察顯示，正常肌腱弱表達BFGF。在肌腱損傷修復實驗組，光鏡觀察顯示陽性細胞呈現(xiàn)多形性外觀，定量資料顯示其數(shù)量與損傷修復時間具有相關性；在損傷1周時間組陽性細胞的數(shù)量開始增加，并明顯多于對照組(P＜0.01)，持續(xù)到損傷修復6周，其數(shù)量仍然顯著多于對照組(P＜0.01)。對不同損傷修復時間組間比較結果顯示，在損傷2周時間組BFGF陽性細胞數(shù)量增

13、加最明顯(P＜0.01)。進一步按照損傷肌腱不同區(qū)域的探察顯示，BFGF陽性細胞在吻合口處的數(shù)量在各損傷修復時間組均多于遠離區(qū)域(P＜0.01)。
　　 Ⅰ型膠原陽性蛋白廣泛存在于肌腱組織的腱纖維和腱細胞之間的基質內(nèi)。免疫組化探察結果顯示，在正常肌腱組織明顯可見陽性結構呈纖維狀位于腱纖維之間。定量資料顯示，在肌腱損傷各時間組的Ⅰ型膠原陽性蛋白的表達明顯高于正常對照組(P＜0.05)。對不同損傷修復時間組間比較結果顯示，Ⅰ型膠原陽

14、性蛋白高表達于損傷之后1周，到第2周時其表達量達到高峰，隨后逐漸下降，到達損傷修復6周時仍高于正常水平(P＜0.05)。
　　 (5)紅花黃色素治療對肌腱損傷修復的影響
　　 *對病灶區(qū)組織病理學變化的影響；通過大體觀察、組化染色結果顯示在不同的損傷修復時間組，紅花黃色素明顯抑制病灶區(qū)組織水腫、粘連程度、和炎癥細胞的浸潤或聚集(P＜0.05)。但紅花黃色素用藥組在各時間組中肌腱細胞的數(shù)量明顯多于非用藥組，兩者之間比較具有

15、統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 *對肌腱抗張力強度的影響：生物力學檢測結果顯示紅花黃色素用藥組在不同的損傷修復時間組與非用藥組之間比較，用藥組肌腱抗張力強度明顯高于非用藥組(P＜0.01)。
　　 *對病灶區(qū)BFGF和Ⅰ型膠原蛋白表達的影響：細胞計數(shù)統(tǒng)計結果顯示紅花黃色素用藥組BFGF陽性細胞數(shù)目在損傷修復各時間組均明顯高于非用藥組(P＜0.01)。Ⅰ型膠原蛋白定量資料顯示紅花黃色素用藥組Ⅰ型膠原蛋白的表達量在各損傷

16、修復時間組均明顯高于非用藥組(P＜0.01)。
　　 結論：
　　 (1)肌腱損傷修復過程中，局部病理變化顯示明顯的時間依賴性
　　 實驗結果證實病灶及其周圍區(qū)的炎癥細胞聚集、水腫和組織細胞的結構變化均發(fā)生于肌腱損傷之后1周，到達2周時其反應和變化達到高峰，隨著損傷修復時間的延長，其反應和變化逐漸減弱和下降。實驗結果同時證實，病灶區(qū)組織的粘連程度則與肌腱損傷修復時間成正相關系；即隨著損傷修復時間的延長，其粘連程度

17、逐漸加重。
　　 (2)BFGF和Ⅰ型膠原蛋白表達對損傷肌腱的修復具有促進作用
　　 實驗結果證實病灶區(qū)的BFGF和Ⅰ型膠原蛋白的高表達變化均發(fā)生于肌腱損傷之后1周，到達2周時其反應和變化達到高峰，與此同時病灶及其周圍區(qū)的炎癥細胞聚集、水腫和組織細胞的結構變化最為嚴重。在BFGF和Ⅰ型膠原蛋白隨著損傷修復時間的延長逐漸減弱和下降的同時，病灶區(qū)組織病理學變化則逐漸減輕，而損傷肌腱的抗張力強度則逐漸增強。提示病灶區(qū)BFGF和

18、Ⅰ型膠原蛋白的表達密切牽涉到損傷肌腱的修復過程，對其修復具有促進作用。
　　 (3)紅花黃色素促進BFGF和Ⅰ型膠原蛋白的表達及其損傷肌腱的修復過程
　　 實驗結果證實病灶區(qū)組織病理學變化、BFGF和Ⅰ型膠原蛋白的表達、損傷肌腱的抗張力強度變化均隨損傷修復時間而不同。但各不同時間組，紅花黃色素用藥組與非用藥組之間上述變化均具有統(tǒng)計學意義，特別是紅花黃色素明顯促進損傷肌腱BFGF和Ⅰ型膠原蛋白的高表達，與此同時病灶區(qū)組織病