MG53對重度燙傷小鼠腎臟保護作用的研究.pdf

1、內(nèi)臟器官是機體各項生命活動的參與者和維持者。嚴重燒傷后，急性的缺血缺氧、炎癥因子等因素，都會造成機體內(nèi)臟器官的損傷。內(nèi)臟器官受損，特別是多臟器功能損傷是燒傷病情加重、并發(fā)癥發(fā)生以及死亡率增加的重要特征。加強重要內(nèi)臟損傷的防治和促進受損臟器早日修復與重建是提高救治成功率和大幅度降低死亡率的關鍵。嚴重燒傷后，由于臟器本身存在肉眼難辨的缺血性損害，加之這類損傷范圍廣，累計器官多，發(fā)病機制復雜、隱蔽以及缺乏有效的促修復措施，因而其損傷后的修復常

2、不易引起人們的重視[1]。既往采取的各種措施，常常僅是針對發(fā)病機制的某一環(huán)節(jié)或減輕其損害程度，并不直接作用于修復細胞本身，故缺乏對臟器的主動修復。因此，如何加速與促進受損內(nèi)臟細胞的主動修復有可能為防治多器官功能障礙綜合癥(multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS)、多臟器功能衰竭(multiplesystemorganfailure，MSOF)發(fā)生以及提高救治成功率提供新的有效途徑，具體重要的理論意義和

3、臨床應用價值。
　　MG53(Mitsugumin53)，一個肌肉特有的TRIM家族蛋白，是細胞膜損傷修復的一個必不可少的組分。Ma等的研究表明，重組的人MG53(RecombinantHumanMitsugumin53，rhMG53)能夠治療肌營養(yǎng)不良癥以及以細胞膜損傷為發(fā)病機理的其他人類疾病。當培養(yǎng)肌肉和非肌肉細胞的培養(yǎng)液中存在rhMG53時，rhMG53能夠識別細胞膜損傷信號，進而提高這些細胞的膜修復能力。小鼠動物實驗研究表

4、明，通過各種途徑（肌內(nèi)、靜脈、皮下）給予rhMG53，都能夠提高骨骼肌細胞膜修復能力，同樣也能一定程度上改善肌營養(yǎng)不良癥的組織病理變化[2]。
　　因此我們推測，機體嚴重燙傷后，通過外源性的rhMG53治療，可能對燙傷造成的各種臟器損傷起到一定的修復作用，改善臟器功能，提高生存率。本研究以30％的Ⅲ度燙傷小鼠為模型，觀察靜脈注射rhMG53對重度燒傷小鼠生存率和臟器組織的保護作用的影響，及其可能的機制。
　　研究內(nèi)容和方法:

5、
　　1.MG53對30％Ⅲ°燙傷小鼠死亡率影響及臟器病理改變的實驗研究
　　1)小鼠Ⅲ°燒傷模型的制作
　　使用YLS-Q5超級臺式溫控燙傷儀致傷Balb/c小鼠，通過溫度和時間兩個因素控制燙傷深度。使用致傷溫度為90℃，自重500g，燙頭直接2cm恒溫金屬燙頭垂直接觸小鼠皮膚6s，8s，10s，經(jīng)HE染色觀察燒傷皮膚組織學改變，確定小鼠Ⅲ°燒傷模型的制作條件。
　　2)MG53對30％Ⅲ°燙傷小鼠死亡率影響及

6、臟器病理改變的研究
　　實驗前分裝外源性rhMG53蛋白。16只20g左右的雄性Balb/c小鼠，隨機分兩組，為MG53實驗組及BSA對照組，分別制作30％Ⅲ°燙傷面積，傷后予以腹腔注射2.5ml乳酸鈉林格注射液，燙傷后0.5h，燙傷后6.5h，分別通過尾靜脈注射外源性rhMG53蛋白及BSA蛋白，傷后每6小時記錄小鼠死亡數(shù)目至傷后48小時，統(tǒng)計死亡率。傷后48小時存活的小鼠心臟灌注，取小鼠的心，肝，脾，肺，腎，小腸，結腸，腦，肌

7、肉，皮膚，胃組織，4％多聚甲醛固定，24h組織脫水，石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察各組組織損傷情況。
　　3)重度燙傷小鼠腎臟損傷的評估
　?、僦囟葼C傷小鼠腎小管壞死程度的評分
　　隨機選取每只小鼠腎臟切片一張，并在顯微鏡下隨機選取20個視野觀察，根據(jù)腎小管的壞死程度，采用Erdogan等的半定量病理評估法評分:評分越高說明腎小管壞死越嚴重，0分:正常腎臟;1分:最少壞死（＜5％腎小管壞死）;

8、2分:輕度壞死(5％～25％腎小管壞死);3分:中度壞死（25％～75％腎小管壞死）;4分:重度壞死（＞75％的腎小管壞死）。分析的實驗結果以(x±s）表示，采用MicrosoftExcel軟件及SPSS13.0統(tǒng)計軟件行統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　?、诿庖呓M織化學SP法檢測重度燙傷小鼠腎臟中KIM-1的表達
　　取前面實驗小鼠的腎臟石蠟切片，分MG53實驗組及BSA對照組，每組選取4張切片，使用腎損傷分子

9、-1(KidneyInjuryMolecule-1，KIM-1)多克隆抗體行免疫組化(IHC)染色，顯微鏡下觀察各組腎臟中KIM-1的表達情況;每張切片隨機選取5個視野，顯微鏡下拍照，拍照后，IPP軟件半定量分析，分析的實驗結果以(x±s）表示，采用MicrosoftExcel軟件及SPSS13.0統(tǒng)計軟件中的獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　2.通過尾靜脈注射的外源性rhMG53蛋白在體內(nèi)的分布及

10、重度燙傷后PTRF體內(nèi)表達的變化
　　1)免疫組化方法檢測外源性rhMG53蛋白在小鼠體內(nèi)的分布
　　取前面實驗小鼠臟器的石蠟切片，使用MG53多克隆抗體，分別進行免疫組織化學染色，以心肌及骨骼肌表達內(nèi)源性MG53組織作陽性對照，觀察其他臟器中外源性rhMG53分分布，顯微鏡下觀察，拍照。
　　2)免疫組化方法檢測正常小鼠及重度燙傷小鼠體內(nèi)的PTRF的表達
　　取正常小鼠及重度燙傷小鼠腎臟的石蠟切片，使用PTRF

11、多克隆抗體，分別進行免疫組化，觀察重度燙傷后，小鼠體內(nèi)PTRF表達的變化，顯微鏡下拍照，拍照后，IPP軟件半定量分析，分析的實驗結果以(x±s）表示，采用MicrosoftExcel軟件及SPSS13.0統(tǒng)計軟件中的獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義;繼續(xù)取重度燙傷小鼠小腸及皮膚石蠟切片，性免疫組化染色，觀察PTRF的表達情況。
　　實驗結果:
　　1.MG53對30％Ⅲ°燙傷小鼠死亡率影響及臟器病理

12、改變的實驗研究
　　1)小鼠Ⅲ°燒傷模型的制作
　　在自然狀態(tài)下，使用燙頭直接接觸小鼠皮膚8s，壓力為500g，燙頭溫度為90℃時，組織學顯示皮膚各層、皮下附件及皮下脂肪組織均發(fā)生凝固性壞死，無完整的細胞結構，真皮內(nèi)膠原腫脹變形，符合Ⅲ°燒傷組織學改變。
　　2)MG53對30％Ⅲ°燙傷小鼠死亡率影響及臟器病理改變的研究
　　MG53給藥組傷后48h的死亡率為25％，BSA組傷后48h的死亡率為37.5％，MG5

13、3給藥組死亡率低于BSA對照組，但統(tǒng)計學Kaplan-Meier分析，P值＞0.05，無統(tǒng)計學差異;HE染色結果顯示，嚴重燒傷后小鼠的心、肝、脾、肺、胃、小腸、結腸、皮膚、肌肉、腦組織等臟器均有不同程度的組織學變化，但MG53給藥組和BSA對照組在上述多數(shù)組織中無明顯的差別，有明顯差別的臟器是腎臟。組織切片顯示MG53給藥組的腎臟近曲小管和遠曲小管上皮細胞濁腫變性、壞死脫落以及腎間質(zhì)炎癥細胞浸潤方面較對照組有明顯改善，腎小球無明顯變化。

14、
　　3)重度燙傷小鼠腎臟損傷的評估
　?、僦囟葼C傷小鼠腎小管壞死程度的評分
　　MG53給藥組的Erdogan半定量病理評分顯著低于BSA對照組腎小管病理損傷評分(P＜0.0001)。
　?、诿庖呓M織化學SP法檢測重度燙傷小鼠腎臟中KIM-1的表達
　　各組腎臟KIM-1免疫組化結果顯示:腎皮質(zhì)髓質(zhì)的損傷部位均可見KIM-1的表達，且表達量隨腎臟損傷范圍及程度的增加而成明顯升高趨勢。顯微鏡下觀察結果顯示，

15、MG53給藥組小鼠腎臟的KIM-1表達明顯弱于BSA對照組，而在用PBS代替一抗的損傷腎臟中，沒有發(fā)現(xiàn)陽性染色;通過IPP軟件分析各組小鼠KIM-1表達的平均光密度顯示，MG53給藥組平均光密度OD值顯著低于BSA對照組，差異有明顯的統(tǒng)計學意義(P＜0.0001)。
　　2.通過尾靜脈注射的外源性rhMG53蛋白在體內(nèi)的分布及重度燙傷后PTRF體內(nèi)表達的變化
　　1)免疫組化方法檢測外源性rhMG53蛋白在小鼠體內(nèi)的分布

16、r>　　免疫組化結果顯示，沒有給予rhMG53的小鼠體內(nèi)，內(nèi)源性MG53主要分布在心肌和骨骼肌，可見骨骼肌細胞胞漿和心肌細胞呈強陽性染色。除心肌和骨骼肌外，其它組織均為陰性。在rhMG53給藥組，小鼠的rhMG53主要分布于部分腎皮質(zhì)腎小管上皮細胞和部分腎髓質(zhì)腎小管上皮細胞，并且強陽性染色主要集中于損傷嚴重的區(qū)域，而對照組在這些部位未見陽性細胞。另外MG53實驗組小鼠的肺臟中，發(fā)現(xiàn)大量rhMG53的分布，且rhMG53主要分布于肺臟部分

17、小靜脈內(nèi)皮細胞胞漿中，而其他組織中未見明顯陽性細胞。
　　2)免疫組化方法檢測正常小鼠及重度燙傷小鼠體內(nèi)的PTRF的表達
　　腎臟PTRF免疫組化結果顯示:正常小鼠腎臟和重度燙傷小鼠腎臟，皆可見大量的強陽性染色，且在腎臟的皮質(zhì)和髓質(zhì)都存在大量的強陽性區(qū)域。顯微鏡下初步觀察結果顯示，兩組腎臟PTRF的表達無明顯差別，而在用PBS代替一抗的腎臟中，沒有發(fā)現(xiàn)陽性染色;通過IPP軟件分析各組小鼠PTRF表達的平均光密度OD值，結果顯

18、示，正常小鼠腎臟平均光密度OD值與重度燙傷小鼠相比，無明顯的統(tǒng)計學差異(P=0.890);另外小鼠的小腸及皮膚中，皆有PTRF的弱陽性表達，較腎臟相比較，陽性區(qū)域的面積及染色強度明顯較弱。
　　實驗結論:動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，尾靜脈注射rhMG53蛋白能夠選擇性到達PTRF的高表達的腎臟。尾靜脈注射rhMG53蛋白能夠降低30％Ⅲ°燙傷小鼠早期死亡的發(fā)生，并改善腎臟的病理損傷情況。上述研究提示，嚴重燒傷后外源性rhMG53蛋白能夠通過