骨髓間充質干細胞腎臟移植及MR示蹤研究.pdf

1、第一部分、間充質干細胞磁粒子標記及經(jīng)腎動脈移植MR成像的實驗研究 目的：分離純化大鼠骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，鑒定其多向分化特性，應用磁性氧化鐵納米粒子和多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine，PLL)的偶聯(lián)物Fe2O3-PLL體外標記MSCs，MR活體示蹤經(jīng)腎動脈移植入大鼠正常腎臟的標記細胞。 方法：制備Fe2O3-PLL，分離大鼠骨髓MSCs進行純化并傳代培養(yǎng)，流式細

2、胞術(FCM)檢測MSCs細胞表型，成骨和成脂肪誘導鑒定骨髓MSCs的多向分化特性。標記Fe2O3-PLL，胎盼藍拒染法檢測細胞活率，觀察標記前后細胞的生長狀況，普魯士藍染色及透射電子顯微鏡顯示細胞內鐵，原子吸收光譜儀進行細胞內鐵定量。分別將標記(9只)和未標記細胞(3只)經(jīng)左腎動脈移植入大鼠正常腎臟，移植后即刻，第1，3，5，8d應用MRI對移植細胞進行活體示蹤并與腎臟普魯士藍染色及CD68抗體染色對照，確認移植MSCs。 結

3、果：獲得MSCs純度高，流式細胞儀結果顯示MSCs細胞均一性好，達99％以上CD29<'+>、CD90<'+>、CD45<'->，具有干細胞特性，可以分化為脂肪和骨細胞。Fe<,2>O<,3>-PLL標記率近100％，普魯士藍染色及電鏡顯示藍色鐵顆粒位于MSCs胞質內。原子吸收光譜儀測定細胞內鐵含量為14.01±4.32pg，MSCs的Fe<,2>O<,3>-PLL標記率近100％，標記對細胞活率及生長狀況無明顯影響。標記細胞移植后大鼠

4、腎臟皮質區(qū)信號強度明顯下降，T<,2>*WI信號改變最明顯，信號強度下降程度隨著時間的延長逐漸減輕，在移植后第8天已比較明顯。組織學分析見絕大多數(shù)標記細胞分布于腎皮質腎小球內，與MRI信號基本一致。MR掃描序列中以T<,2>*WI的信號強度變化最大。未標記細胞移植后未見腎臟信號改變。 結論：獲得骨髓MSCs純度高，具有干細胞特性；Fe<,2>O<,3>-PLL可以對其進行安全有效的標記；經(jīng)腎動脈移植入正常大鼠腎臟的MSCs彌漫分

5、布于腎小球內，臨床應用型1.5T磁共振儀可對移植的標記細胞進行活體示蹤。 第二部分、間充質干細胞急性腎功能衰竭大鼠腎動脈移植MR活體示蹤研究 目的：建立急性腎功能衰竭(acute renal failure，ARF)模型，應用Fe<,2>O<,3>-PLL標記大鼠骨髓MSCs，MR活體示蹤經(jīng)腎動脈移植入ARF大鼠體內的標記細胞，觀察其分布，為經(jīng)動脈移植MSCs治療ARF提供基礎。 方法：Fe<,2>O<,3>-P

6、LL標記大鼠骨髓MSCs細胞，普魯士藍染色顯示細胞內鐵。采用后肢肌肉注射甘油建立ARF大鼠模型，將模型大鼠分為2組，分別經(jīng)左。腎動脈移植入標記細胞(6只)和未標記細胞(5只)，移植后即刻及第1、3、5、8天應用MR的T<,2>*WI對腎臟進行活體成像，測量腎臟皮質信噪比(signal-to-noise ratio，SNR)的變化，對移植細胞進行活體示蹤，并與腎臟組織切片普魯士藍染色和HE染色對照。 結果：MSCs的Fe<,2>O

7、<,3>-PLL標記率近100％，普魯士藍染色顯示藍色鐵顆粒位于MSCs胞質內。標記細胞移植后ARF大鼠腎臟皮質區(qū)信號強度明顯下降，以T<,2>*WI信號改變最明顯，一直持續(xù)到移植后第8天。與注射前比較，標記細胞移植后即刻及1、3、5、8d腎臟皮質SNR差異具有統(tǒng)計學意義(ANOVA，F(xiàn)=75.458，P<0.05；LSD test，P<0.05；t值分別為7.52，7.34，7.29，6.84，5.01，P<0.05)。未標記細胞移植

8、后各時間點與移植前比較，SNR改變差異無統(tǒng)計學意義(ANOVA，F(xiàn)=0.609，P>0.05)。組織學分析見絕大多數(shù)標記細胞分布于腎皮質腎小球內，與MRI信號改變區(qū)域基本一致。 結論：經(jīng)腎動脈移植入ARF大鼠腎臟的MSCs經(jīng)臨床應用型1.5 T磁共振儀活體示蹤顯示其在早期彌漫分布于ARF腎臟腎小球內，具有和同樣途徑移植入正常腎臟中的MSCs相似的分布特點。 第三部分、MR 活體監(jiān)測間充質干細胞腹主動脈移植治療急性腎功能衰

9、竭研究 目的：Fe<,2>O<,3>-PLL體外標記骨髓：MSCs，MR活體監(jiān)測同種異體移植入ARF大鼠腹主動脈的標記細胞并檢測大鼠腎功能及腎臟病理改變，探討其腹主動脈移植后治療ARF的體內分布及可能機制。 方法：磁性納米粒子體外標記大鼠骨髓MSCs。ARF大鼠分為3組，插導管至腹主動脈，分別移植入標記細胞(A組，10只)；移植入未標記細胞(B組，10只)；灌注等量生理鹽水(C組，10只)。移植后1小時及第1、2、4天應

10、用MR的T<,2>*WI對大鼠腎臟進行成像，測量腎臟信噪比(SNR)的變化，對移植細胞進行活體示蹤，并與腎臟普魯士藍染色對照，確認移植MSCs。各個時間點監(jiān)測大鼠腎功能指標包括：血清尿素氮(BUN)和肌酐(SCr)；監(jiān)測腎臟病理變化情況，包括HE、過碘酸雪夫反應染色(periodic acildShiff,PAS)、免疫組織化學(包括Bcl-2、PCNA抗體)染色，監(jiān)測并比較腎臟損傷程度及腎小管細胞凋亡及增殖情況；電鏡觀察腎小管超微結構

11、改變。 結果：A組標記細胞移植后1 h MR掃描示腎臟皮質外帶信號即有明顯下降，可見點狀低信號帶，信號改變持續(xù)至細胞移植后4d，與注射前比較，A組移植后1h及1、2、4 d腎臟皮質外帶SNR差異具有統(tǒng)計學意義(ANOVA，F(xiàn)=125.6，P<0.05；LSD test，P<0.05：t值分別為7.64，7.50，7.69，7.43，P<0.05)，明顯下降。B組未標記細胞移植后各時間點與移植前比較，SNR改變差異無統(tǒng)計學意義(A

12、NOVA，F(xiàn)=0.413，P>0.05)。組織學分析見標記細胞分布于腎皮質腎小球內，與MR信號改變一致。細胞移植組腎功能優(yōu)于對照組C，腎損傷程度及凋亡比對照組明顯減輕，腎小管上皮增殖增加；電鏡觀察示腎小管超微結構損傷細胞移植組亦輕于對照組。A、B組之間各項腎損傷指標均無顯著差異。 結論：臨床應用型1.5 T磁共振儀可活體監(jiān)測顯示移植入ARF大鼠腹主動脈的MSCs，移機后早期細胞分布于腎皮質腎小球內；MSCs移植后早期可促進ARF

13、恢復，可能通過除橫向分化以外的途徑發(fā)揮ARF的治療作用。 第四部分、間充質干細胞急性腎功能衰竭大鼠體內分布的示蹤研究 目的：觀察磁粒子標記后綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)轉基因小鼠骨髓MSCs靜脈移植后在ARF大鼠體內分布情況，MR對其進行活體示蹤，探討其改善ARF動物模型腎損害的可行性及可能機理。 方法：Fe<,2>O<,3>-PLL體外標記GFP轉基因小鼠骨髓MSC

14、s。36只SD大鼠，30只制作ARF模型，分成A、B、C 3組，A組(n=10)為尾靜脈注射磁粒子標記的GFP陽性MSCs，B組(n=10)為尾靜脈注射GFP陽性MSCs，C組(n=10)尾靜脈注射等量生理鹽水。另外D組(n=6)未做腎衰模型，為正常對照組，不做任何干預。各組細胞移植前，移植后1天、3天各個時間點取3只進行MR掃描并處死，剩余大鼠及D組大鼠于移植后10天行MR掃描后全部處死。所有大鼠處死前抽血檢測腎功能指標。處死后行組織

15、學檢查包括普魯士藍染色與綠色熒光對照觀察，確認移植MSCs；HE、PAS染色監(jiān)測并比較腎臟損傷程度。 結果：A組標記細胞移植前后各個時間點的MR掃描。腎臟信號SNR，與B、C組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。A組標記細胞移植后1天MR掃描示肝臟信號即有明顯下降，隨著時間延長，信號降低的程度下降，與注射前比較，A組移植后1、3、10天肝臟的SNR差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，10天時SNR仍較低，與B組比較差異仍有統(tǒng)計

16、學意義(P<0.05)。A、B組早期GFP陽性細胞主要分布于肝竇內，A組綠色熒光細胞與普魯士藍染色陽性細胞對應，與MR一致。A、B組早期即可見MSCs細胞分布于腎小管上皮，但腎臟MR信號無明確改變。細胞移植組腎功能優(yōu)于對照組C，腎損傷程度比對照組明顯減輕。 結論：磁粒子標記法對骨髓MSCs的ARF治療作用無明顯影響。急性腎功能衰竭狀態(tài)下早期經(jīng)靜脈移植后MSCs較多分布于肝臟，少量MSCs在稍晚時期可以遷移到腎小管區(qū)，但臨床型MR