Cdc6在小鼠肝切除后肝再生中作用的研究.pdf

1、目的：本試驗分二個部分：1、設(shè)計并構(gòu)建小鼠Cdc6基因的RNAi真核表達載體pGCsi_U6/Neo/GFP/RNAi。通過尾靜脈快速注射法將真核表達載體pGCsi-U6/Neo/GFP/RNAi轉(zhuǎn)染至小鼠肝細胞中，運用熒光顯微鏡及RR-PCR方法觀察干擾效果。2、通過觀察肝切除后小鼠肝細胞中Cdc6表達變化及其對肝細胞增殖和細胞周期的影響來探討其在肝切除后肝再生的作用。 方法： 根據(jù)GenBank中Cdc6的序列，設(shè)計

2、并構(gòu)建小鼠Cdc6基因的RNAi真核表達載體pGCsi_U6/Neo/GFP/RNAi。通過尾靜脈將質(zhì)?？焖僮⑸淙胄∈篌w內(nèi)，觀察其對肝細胞中Cdc6基因表達的影響。以此組小鼠為RNAi組，同時設(shè)立空載體組及空白對照組。采用Higgins＆Aderson創(chuàng)建的經(jīng)典小鼠肝部分切除術(shù)模型，即分別于肝左葉、中葉根部結(jié)扎切除。在術(shù)后0h、6h、12h、24h、72h五個不同的時相點，分離肝細胞。肝細胞分離方法采用肝臟原位勻速加離體循環(huán)膠原酶灌注法

3、，得到肝細胞沉淀。通過臺盼藍染色判斷測定細胞活性，細胞計數(shù)。①用流式細胞法檢測各組細胞增殖周期的變化②裂解細胞提取蛋白及RNA，采用Westernblot和RT-PCR方法測定各組細胞的Cdc6蛋白及基因表達情況。⑧有3H-亮氨酸摻入法檢測各組細胞的增殖率。 結(jié)果： 1.經(jīng)測序驗證，Cdc6基因的RNAi真核表達載體的模板序列與設(shè)計序列完全正確，成功構(gòu)建pGCsi_U6/Neo/GFP/RNAi干擾質(zhì)粒。 2.通

4、過尾靜脈注射法將質(zhì)粒pGCsi_U6/Neo/GFP/RNAi轉(zhuǎn)染到小鼠肝細胞中，經(jīng)熒光顯微鏡觀察到綠色熒光。 3.經(jīng)過多次實驗，平均每只鼠肝可獲取1.5×107個肝細胞。經(jīng)臺盼藍拒染實驗測定細胞平均活性為96％。剛剛分離的肝細胞倒置顯微鏡下觀察可見肝細胞呈單個分散狀態(tài)，呈圓球形，細胞折光性強，接種4h后肝細胞貼壁、伸展，連接成條索狀；24h后絕大多數(shù)肝細胞貼壁，呈扁平狀、體積明顯增大，連接成島嶼狀；48h后肝細胞貼壁牢固，伸展

5、為上皮樣，連接成片。分離培養(yǎng)的細胞形態(tài)完全符合典型的肝細胞形態(tài)特征。 4.在空載體組及空白對照組中，肝細胞中Cdc6的含量由6h開始升高，在24h達到高峰(P＜0.01)，72h有所降低；RNAi組Cdc6蛋白的含量在各時相點均表現(xiàn)為低水平表達，在各時相點之間變化趨勢也不明顯。 5.在術(shù)后12h、24h、48h和72h時相點，空載體組及空白對照組肝細胞3H-亮氨酸摻入率分別與RNAi組相比較在統(tǒng)計學(xué)上有非常顯著差異(P＜

6、0.01)。從組內(nèi)比較看，空白對照組隨時間的變化細胞3H-亮氨酸摻入率在持續(xù)增加，從術(shù)后6h即有變化，24h更為明顯，但是24h到72h之間變化較慢，維持在較高水平；空載體組和空白對照組具有相似性變化；而實驗組術(shù)后3H-亮氨酸摻入率0h-72h一直保持在較低水平，變化不大。 6.與RNAi組相比，空載體組與空白對照組G0/G1期細胞逐漸降低，S期細胞明顯增加，在術(shù)后各個時相點與RNAi組有明顯差異(P＜0.05或者P＜0.01)

7、，其高峰在術(shù)后24h，72h有明顯降低。另外，空載體組和空白對照組相比較，差異無顯著性。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建pGCsi_U6/Neo/GFP/RNAi干擾質(zhì)粒，并通過尾靜脈注射法成功將質(zhì)粒pGCsi_U6/Neo/GFP/RNAi轉(zhuǎn)染到小鼠肝細胞中。 2.小鼠肝部分切除術(shù)后早期Cdc6表達增加，由6h開始升高，在24h達到高峰，72h有所降低，提示Cdc6基因在肝切除術(shù)后早期即被激活。 3.小鼠肝部分切

8、除術(shù)后早期即被激活的Cdc6基因可以明顯促進肝細胞的蛋白質(zhì)合成和細胞生長。隨著術(shù)后時間的延長，肝細胞3H-亮氨酸摻入率在持續(xù)增加，從術(shù)后6h升高，24h達到高峰，72h開始降低；而轉(zhuǎn)染后的小鼠肝細胞3H-亮氨酸摻入率則變化不大。 4.小鼠肝部分切除術(shù)后肝細胞明顯處于增殖狀態(tài)，G0/G1期細胞逐漸降低，S期細胞明顯增加。而轉(zhuǎn)染后小鼠肝細胞則停滯于G0/G1期，說明這種增殖狀態(tài)和Cdc6基因在肝部分切除術(shù)后早期激活密切相關(guān)。也說明C