跨膜4超家族成員9與大腸癌轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究.pdf

1、本研究試圖用基因芯片技術(shù)篩選三株具有不同轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)腸癌細胞株的差異表達基因，從中挑選出有可能影響腫瘤轉(zhuǎn)移的基因作為研究對象，從分子和細胞水平深入探討該基因?qū)Y(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)移能力的影響，旨在研究對大腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，不僅有利于闡明大腸癌轉(zhuǎn)移的分子機制，而且還能為臨床上預(yù)測轉(zhuǎn)移、基因治療和預(yù)后判斷尋找新的有效靶點。 一、基因芯片技術(shù)篩選三株具不同轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)腸癌細胞株的差異表達基因，確定研究目的基因，驗證基因芯片檢查結(jié)果 1

2、、確定三個細胞株轉(zhuǎn)移能力的差異用異質(zhì)粘附實驗和趨化運動實驗確定LST、SW480和Lovo三個細胞株之間轉(zhuǎn)移能力的差異。 2、基因芯片以一對樣本的信號平均值＞2或個＜2而另個＞10；信號值變異系數(shù)＜0.33；信號平均值有2倍以上表達差異作為判定基因差異表達的標準。在明顯表達上調(diào)的基因中與轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因有：發(fā)動蛋白2、ADP-核糖基化因子1。在明顯下調(diào)表達的基因中，與轉(zhuǎn)移有關(guān)系的有跨膜4超家族成員9，又稱四分子交聯(lián)體5。TM4SF

3、9在結(jié)腸癌中的表達，為本研究首次報道，選擇該基因作為研究對象。 3、基因水平驗證基因芯片結(jié)果用半定量RT-PCR技術(shù)，結(jié)果顯示TM4SF9mRNA在三個細胞株中的表達水平差異與基因芯片檢測結(jié)果相符。 4、蛋白水平驗證基因芯片結(jié)果細胞免疫組化技術(shù)定性，免疫印跡技術(shù)、免疫熒光技術(shù)結(jié)合流式細胞儀技術(shù)定量研究。結(jié)果顯示TM4SF9蛋白表達水平差異與基因芯片檢測結(jié)果相符。 5、組織定位研究：臨床結(jié)腸癌及癌旁正常組織免疫組化

4、研究表明，TM4SF9定位在結(jié)腸粘膜細胞的細胞膜上，結(jié)腸癌細胞表達明顯強于正常結(jié)腸粘膜細胞。 二、體外實驗觀察改變TM4SF9表達水平對結(jié)腸癌細胞株轉(zhuǎn)移相關(guān)生物學(xué)行為的影響 1、克隆Lovo細胞TM4SF9基因，轉(zhuǎn)染LST細胞，構(gòu)建穩(wěn)定表達細胞系構(gòu)建TM4SF9.pEGFP-C1重組質(zhì)粒，用Lipofectamine2000TM.轉(zhuǎn)染入LST細胞，同時轉(zhuǎn)染pEGFP-C1質(zhì)粒做對照。 2、RNAi下調(diào)Lovo細胞

5、TM4SF9表達設(shè)計siRNA片段，用化學(xué)合成法合成，用Lipofectamine2000TM導(dǎo)入Lovo細胞中，干擾TM4SF9表達。流式細胞儀及免疫蛋白印跡檢測證明干擾成功，Lovo細胞TM4SF9蛋白表達水平明顯下降。 3、異質(zhì)粘附實驗實驗結(jié)果顯示：改變TM4SF9表達水平后，細胞粘附能力發(fā)生改變，上調(diào)TM4SF9表達可增強細胞異質(zhì)粘附性，下調(diào)TM4SF9表達則降低細胞的異質(zhì)粘附性。 4、趨化運動實驗實驗結(jié)果顯示，

6、改變TM4SF9表達水平對結(jié)腸癌對運動性影響無顯著性意義。 結(jié)論： 1、LST、SW480及Lovo細胞株具有不同轉(zhuǎn)移潛能，Lovo＞SW480＞LST。 2、LST、SW480、Lovo細胞TM4SF9表達水平有差異，Lovo＞SW480＞LST。 3、TM4SF9在結(jié)腸粘膜細胞膜上有表達，與正常結(jié)腸粘膜細胞相比，結(jié)腸癌細胞TM4SF9表達明顯增強； 4、改變TM4SF9表達水平可以改變結(jié)腸癌細