PPARβ-δ激活對大鼠心肌成纖維細胞膠原表達和細胞增殖的影響.pdf

1、高血壓病是一種常見病、多發(fā)病，極易導致心、腦、腎等靶器官損害，嚴重威脅人類的健康。其中，由心臟成纖維細胞(cardiac fibroblast，CFs)增殖和膠原表達過多所導致的心肌纖維化是高血壓心室肥厚由代償向失代償轉化的重要病理過程，是引發(fā)心力衰竭的核心環(huán)節(jié)。目前心肌纖維化的確切發(fā)病機制并不十分明確，但近年來心肌纖維化的治療已成為國內外研究的熱點。其中，過氧化物酶體增殖劑激活型受體(peroxisome proliferators-

2、activated receptors，PPARs)與心肌纖維化的關系越來越受到人們的關注。PPARα和PPARγ激活可以抑制心肌纖維化，但與它們結構和功能相類似的PPARβ/δ對心肌纖維化的作用卻未見報道。 本研究旨在細胞水平模擬心肌纖維化，探索PPARβ/δ激活對血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)誘導的成年大鼠CFs膠原表達和細胞增殖的影響及其可能的機制，為心肌纖維化的治療提供新的作用靶點，以有利于抗心肌

3、纖維化藥物的研發(fā)。 第1章成年大鼠心肌成纖維細胞PPARβ/δ的表達情況。 目的： PPARβ/δ體內分布廣泛，其中心臟PPARβ/δ表達水平較高。心臟主要由心肌細胞和CFs組成。心肌細胞表達PPARβ/δ，但CFs是否表達PPARβ/δ至今尚未見報道。本研究體外成功地培養(yǎng)了成年大鼠CFs，并在此基礎之上探討成年大鼠CFs是否表達PPARβ/δ。 方法： 1.采用膠原酶—胰酶—膠原酶消化和差速貼壁

4、法分離成年大鼠CFs。倒置顯微鏡和免疫細胞化學染色鑒定細胞，同時繪制細胞生長曲線了解生長特性。 2.以乳鼠心肌細胞作為陽性對照，采用RT-PCR和Westem blot研究成年大鼠CFs是否表達PPARβ/δ。 3.從mRNA水平研究CFs中PPARs 3個亞型的表達情況。 結果： 1.采用膠原酶—胰酶—膠原酶法分離細胞，細胞收率高，而且培養(yǎng)成本較低。倒置顯微鏡下，原代培養(yǎng)的CFs呈梭形或不規(guī)則三角形，胞

5、質淡折光性強，細胞核較大，呈橢圓形，無自發(fā)性搏動。培養(yǎng)的細胞波形蛋白染色陽性，Ⅷ因子染色陰性，α-actin染色陰性，符合CFs染色特征，細胞純度大于98﹪。第3-5代CFs的生長曲線無明顯差異，適于開展細胞實驗。 2.成年大鼠CFs在mRNA和蛋白兩個水平都檢測到PPARβ/δ表達，而且CFs的PPARβ/δ表達量較心肌細胞低(P<0.01)。 3.CFs同時表達PPARs 3個亞型，PPARβ/δ和。PPARα表達量

6、較高，而PPAR7表達量最低(P<0.01)。 結論： 我們建立的成年大鼠CFs培養(yǎng)方法成本較低，細胞收率較高，細胞純度高，第3-5代細胞適于開展相關實驗。成年大鼠CFs表達PPARβ/δ，而且在。PPARs 3個亞型中表達量較高。CFs表達PPARβ/δ是開展后續(xù)實驗的前提和基礎。 第2章GW501516對心肌成纖維細胞膠原表達和細胞增殖的影響。 目的： PPARa和PPARγ激活可以抑制心肌纖

7、維化，但與它們結構和功能相類似的PPARβ/δ對心肌纖維化的效應卻未見報道。本研究成功地建立了Ang Ⅱ誘導的成年大鼠CFs膠原表達和細胞增殖的模型，并在此基礎之上探討PPARβ/δ激動劑GW501516對細胞膠原表達和細胞增殖的影響。 方法： 1.摸索AngⅡ刺激成年大鼠CFs膠原表達和細胞增殖的量效和時效關系，建立AngⅡ誘導的CFs膠原表達和細胞增殖模型。 2.利用MTT法探索成年大鼠CFs使用GW5015

8、16的安全劑量范圍。 3.采用Western blot、<'3>H-proline摻入和<'3>H-TdR摻入等方法，探討GW501516對Ang Ⅱ誘導的成年大鼠CFs膠原表達、膠原合成和細胞增殖的影響。 結果： 1.(1-1000)nM Ang Ⅱ作用于CFs(6-36)h，可以濃度依賴和時間依賴地促進CFs表達Ⅰ型膠原。(0.1-1000)nMAngⅡ作用于CFs(12-48)h，可以濃度依賴和時間依賴地增

9、加CFs對<'3>H-TdR的攝取量。 2.(1nM-1μM)GW501516對CFs的細胞數無影響(P>0.05 vs.對照組)，而10μM的GW501516明顯地降低CFs的細胞數(P<0.01 VS.對照組)。 3.(1nM-1μM)GW501516預處理CFs 1h，可以濃度依賴性地抑制Ang Ⅱ誘導的CFs膠原表達和膠原合成，而GW501516本身對細胞的膠原表達和膠原合成無影響。(1nM-1μM)GW5015

10、16濃度依賴性地抑制AngⅡ誘導的CFs<'3>H-TdR的攝取，而GW501516不影響細胞對<'3>H-TdR的基礎攝取量。 結論： 成功建立AngⅡ誘導的CFs膠原表達和細胞增殖的細胞模型。eeARβ/δ激動劑GW501516可以抑制Ang Ⅱ誘導的細胞膠原表達和細胞增殖，其中抑制細胞膠原表達的效應與其降低細胞膠原的合成有關。 第3章PPARβ/δ激活介導GW501516對心肌成纖維細胞的效應。 目

11、的： GW501516可以抑制AngⅡ誘導的細胞膠原表達和細胞增殖。GW501516的效應除可能通過激活PPARβ/δ來實現外，也可能通過調節(jié)PPARβ/δ的表達量或通過不依賴于PPARβ/δ的途徑來實現。本研究觀察了GW501516對CFs PPARβ/δ表達量的影響，并利用RNA干擾(RNA interference，RNAi)來探索GW501516的作用是否依賴于PPARβ/δ。 方法： 1.采用RT-PC

12、R和Western blot探討GW501516是否影響CFs PPARβ/δ的表達量。 2.以Stealth RNAi Negative Control作為陰性對照，3對針對PPARβ/δ的Stealth siRNA(RSS340860、RSS340861和RSS340862)轉染CFs。轉染細胞48h后，RT-PCR和Western blot檢測各組細胞PPARβ/δ的表達水平，篩選有效干擾序列。 3.有效干擾序列抑

13、制細胞PPARβ/δ表達后，采用Western blot、<'3>H-proline和<'3>H-TdR摻入等方法研究GW501516對Ang Ⅱ誘導的細胞膠原表達、膠原合成和細胞增殖的效應有無變化。 結果： 1.GW501516、Ang Ⅱ和GW501516+Ang Ⅱ組細胞PPARβ/δ的表達量與對照組相比無差異(P>0.05)。 2.Negative Control不影響CFs PPAR~的表達(P>0.0

14、5 vs.對照組)。而3對Stealth siRNA都顯著地抑制細胞PPARβ/δ的mRNA和蛋白表達(p<0.01 vs.對照組)，其中RSS340860的抑制作用最強，分別降低PPARβ/δmRNA和蛋白表達83﹪和80﹪。 3.RSS340860抑制CFs PPARβ/δ表達后，逆轉了GW501516對Ang Ⅱ誘導的細胞膠原表達、膠原合成和細胞增殖的抑制作用(p<0.01 vs.GW501516+AngⅡ組)。而Nega

15、tive Control對GW501516的效應無影響(p>0.05 vs.GW501516+AngⅡ組)。 結論： GW501516不影響CFs PPARβ/δ的受體表達量；RSS340860能顯著地抑制CFs PPARβ/δ的表達；GW501516對CFs的效應具有PPARβ/δ依賴性。因此，PPARβ/δ激活介導了GW501516對CFs的效應。 第4章初步探討PPARβ/δ激活所產生效應的機制。

16、目的： 本實驗旨在研究PPARβ/δ激活所產生效應的可能機制。以往的研究表明，Ang Ⅱ誘導的CFs膠原表達和細胞增殖可能與其刺激細胞生成活性氧(reactiveoxygen species，ROS)有關。而PPARγ激動藥通過調節(jié)細胞ROS的生成，可以抑制細胞膠原表達和細胞增殖。PPARβ/δ的效應也可能與其調節(jié)細胞ROS的生成有關。 方法： 1．熒光顯微鏡和流式細胞儀測定GW501516是否影響Ang Ⅱ誘導

17、的CFsROS生成。 2．采用Western blot、<'3>H-proline摻入和<'3>H-TdR摻入等方法，探討ROS是否參與GW501516對CFs膠原表達、膠原合成和細胞增殖的抑制作用。 結果： 1．與對照組相比，AngⅡ組CFs ROS的生成顯著增加(p<0．01)，GW501516組細胞ROS的生成無明顯變化(p>0．05)。而GW501516預處理CFs后顯著地抑制AngⅡ誘導的CFs ROS