漸狹蠟蚧菌(Lecdanicillium attenuatum)介導(dǎo)的RNAi對(duì)柑橘粉虱毒力探究.pdf

1、柑橘粉虱(Diaelorude citri Asahmaed)是廣泛存在于世界柑橘產(chǎn)區(qū)的重要害蟲(chóng)。由于其具有刺吸式口器，可以吸食柑橘汁液，為害嚴(yán)重后引起落葉落果;更為可怕的是，柑橘粉虱可分泌黏性蜜露，蜜露將空氣中的灰塵吸附到葉片表面，并為一些霉菌提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而引發(fā)煤煙病，嚴(yán)重影響柑橘光合作用，造成減產(chǎn)。目前防治柑橘粉虱的主要方法是化學(xué)防治，但化學(xué)藥劑施用不當(dāng)往往導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、昆蟲(chóng)抗藥性等一系列的問(wèn)題。漸狹蠟蚧菌（子囊菌綱，肉座菌目，

2、蠟蚧菌屬）作為一種重要的昆蟲(chóng)病原真菌，它可以穿透粉虱體壁，消耗其營(yíng)養(yǎng)，最終導(dǎo)致粉虱死亡，這為研制環(huán)保型微生物農(nóng)藥提供了可能。但是由于漸狹蠟蚧菌毒力弱，侵染周期長(zhǎng)，還很難與化學(xué)農(nóng)藥競(jìng)爭(zhēng)。本研究通過(guò)構(gòu)建基于粉虱免疫基因的RNAi載體，將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入蠟蚧菌，以期真菌侵染粉虱之際，釋放dsRNA，對(duì)粉虱免疫基因?qū)嵭懈蓴_，減弱昆蟲(chóng)對(duì)病原真菌的免疫反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)毒力的增強(qiáng)。實(shí)施步驟如下:
　　1.絲狀真菌RNAi載體的構(gòu)建
　　以pBHt

3、2質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增PtrpC啟動(dòng)子和PtrpC+ HygR元件;以pAN7-1為模版，擴(kuò)增TtrpC終止子;利用StuⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶酶切掉pFGC5941的35S啟動(dòng)子，置換上PtrpC啟動(dòng)子，構(gòu)建成PtrpC+ Intron結(jié)構(gòu);利用MssⅠ和SmaⅠ內(nèi)切酶酶切掉pFGC5941的OCS終止子，置換上TtrpC終止子，構(gòu)建成PtrpC+Intron+TtrpC結(jié)構(gòu);利用EcoRⅠ和PstⅠ內(nèi)切酶酶切掉pFGC5941的MAS+Bl

4、pR元件，置換上PtrpC+ HygR元件。構(gòu)建成PtrpC+ hygR+ PtrpC+ Intron+TtrpC結(jié)構(gòu)。至此RNAi載體改造完成，并將改造后的載體命名為pRCy1。
　　2.基于粉虱免疫基因RNAi載體的構(gòu)建
　　查找柑橘粉虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，找到參與粉虱免疫相關(guān)的酚氧化酶原基因(PPO)、酚氧化酶原激活因子基因(PPO-AF)、溶菌酶基因(LZM)并設(shè)計(jì)引物，以cDNA為模板，克隆獲得PPO，PPO-AF，LZ

5、M以及PPO+PPO-AF融合基因的正反向結(jié)構(gòu)，利用XhoⅠ和SwaⅠ酶切位點(diǎn)將以上4個(gè)基因的正向結(jié)構(gòu)連入pRCy1載體;利用XbaⅠ和BamHⅠ位點(diǎn)將4個(gè)基因的反向結(jié)構(gòu)連入pRCy1載體，構(gòu)建完成ihpRNA表達(dá)盒。
　　3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ihpRNA表達(dá)盒轉(zhuǎn)化進(jìn)入漸狹蠟蚧菌
　　將構(gòu)建完成的RNAi載體電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)入EHA105農(nóng)桿菌菌株，通過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)和共培養(yǎng)，將質(zhì)粒ihpRNA表達(dá)盒整合進(jìn)入漸狹蠟蚧菌基因組中，在含有潮霉素

6、B的篩選培養(yǎng)基中獲得轉(zhuǎn)化成功的陽(yáng)性菌株。
　　4.轉(zhuǎn)基因漸狹蠟蚧菌的效果評(píng)價(jià)
　　測(cè)定轉(zhuǎn)基因蠟蚧菌的單位產(chǎn)孢量和菌絲生長(zhǎng)速率，發(fā)現(xiàn)與野生型菌株相比，轉(zhuǎn)基因菌株的生長(zhǎng)速率沒(méi)有發(fā)生顯著性變化;而單位產(chǎn)孢量除La∷GFP菌株顯著增加外，其他菌株均沒(méi)有發(fā)生顯著變化。
　　將轉(zhuǎn)基因菌株在不含潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)10代，利用特異性引物檢測(cè)菌株的遺傳穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)第十代真菌均可擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶。說(shuō)明農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化蠟蚧菌具有