游離膽固醇過載誘導平滑肌細胞損傷的相關(guān)機制研究.pdf

1、動脈粥樣硬化疾病是現(xiàn)代社會中最為常見的心血管疾病之一，其發(fā)病機理復雜，是一種多致病因素的高發(fā)病率疾病。在動脈粥樣硬化的病理過程中，泡沫化細胞的出現(xiàn)和動脈粥樣硬化斑塊的形成被認為是動脈粥樣硬化的病理特征。在病變后期，動脈粥樣硬化斑塊區(qū)域內(nèi)過量的平滑肌細胞損傷及死亡直接影響了斑塊區(qū)域結(jié)構(gòu)的完整性，降低斑塊穩(wěn)定性，最終導致斑塊破裂并形成血栓，造成血管堵塞，因此平滑肌細胞的死亡在動脈粥樣硬化發(fā)病過程中起了重要作用。
　　 在體內(nèi)，泡沫化

2、細胞的來源主要是巨噬細胞和平滑肌細胞。在以往的實驗中，泡沫化細胞的研究主要集中于巨噬細胞的泡沫化模型，對于平滑肌細胞來源的泡沫化細胞模型研究較少。最近的研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)過量的游離膽固醇可能是造成巨噬細胞源泡沫化細胞死亡的原因之一。游離膽固醇可能通過激活線粒體凋亡通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路導致巨噬細胞源泡沫化細胞的凋亡。但細胞內(nèi)過量游離膽固醇和平滑肌細胞死亡之間的聯(lián)系還未見報道。
　　 本論文采用大鼠胸/腹主動脈平滑肌細胞和水溶性膽固醇

3、(CHOL:MβCD)共孵育的方法建立起平滑肌來源的泡沫化細胞模型，并結(jié)合細胞內(nèi)酰基輔酶A：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)的特異性阻斷劑Sandoz58035，建立起游離膽固醇過載的平滑肌細胞模型。通過對病變平滑肌細胞內(nèi)的鈣離子、線粒體鈣、活性氧(ROS)濃度、線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)、線粒體膜電位等觀察分析以及線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路上相關(guān)蛋白的表達情況的測定對游離膽固醇造成的平滑肌細胞早期損傷和細胞凋亡壞死機制作出了初步的研究。本論文還通過觀察自

4、噬小體的形成以及自噬特異性標志蛋白LC3含量變化的測定檢測了平滑肌細胞在游離膽固醇刺激下自噬的激活情況。結(jié)合藥物干擾自噬在平滑肌細胞內(nèi)的激活，從細胞和分子水平研究了游離膽固醇激活平滑肌細胞內(nèi)自噬產(chǎn)生的發(fā)生機制。本論文對游離膽固醇過載情況下平滑肌細胞內(nèi)一系列生理病理的變化進行了模擬，對相關(guān)細胞機制進行了分析，為深入理解動脈粥樣硬化的發(fā)病機理和發(fā)病過程提供了理論基礎。
　　 本論文得到的主要研究成果有：
　　 1.利用平滑肌

5、細胞和水溶性膽固醇共孵育建立起平滑肌細胞源的泡沫化細胞模型。同時利用ACAT酶特異性阻斷劑Sandoz58035作用于平滑肌源的泡沫化模型建立游離膽固醇過載的細胞模型，模擬了動脈粥樣硬化中后期平滑肌細胞的病變過程。
　　 2.利用泡沫化模型和游離膽固醇過載模型，比較兩類細胞模型內(nèi)鈣離子，線粒體鈣離子以及細胞內(nèi)ROS含量水平的變化。實驗發(fā)現(xiàn)在游離膽固醇載入過程中細胞內(nèi)鈣離子和線粒體鈣離子濃度出現(xiàn)明顯下降，而ROS含量隨孵育時間的增

6、加而上升，在正常細胞和泡沫化平滑肌細胞中這三種物質(zhì)濃度基本維持在穩(wěn)定的水平，驗證了細胞內(nèi)多余的游離膽固醇影響了平滑肌細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài).
　　 3.對平滑肌細胞的線粒體進行熒光標記和線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)動力學的實時觀察、記錄、分析。發(fā)現(xiàn)在游離膽固醇過載的平滑肌細胞中，線粒體在游離膽固醇載入后4-8小時內(nèi)發(fā)生斷裂，由正常狀態(tài)下的網(wǎng)狀轉(zhuǎn)變?yōu)樗辄c狀。
　　 4.從線粒體介導的細胞凋亡通路以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導的細胞凋亡通路對游離膽固醇造成的平

7、滑肌細胞凋亡壞死進行進一步的分析。實驗發(fā)現(xiàn)游離膽固醇的載入可以導致線粒體膜電位的崩解，改變細胞內(nèi)bcl-2、bax蛋白含量并導致線粒體內(nèi)cytoc的釋放，同時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力蛋白KDEL表達量在游離膽固醇的刺激下大大上升并激活UPR反應過程中CHOP蛋白的表達.說明游離膽固醇通過線粒體凋亡通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路的激活造成細胞死亡。
　　 5.對游離膽固醇過載的平滑肌細胞內(nèi)自噬的水平進行了研究。發(fā)現(xiàn)游離膽固醇的載入可以導致平滑肌細胞內(nèi)發(fā)生

8、自噬。同時發(fā)現(xiàn)自噬的程度和游離膽固醇載入的濃度和時間均有關(guān)系。利用自噬的阻斷劑3-MA和增強劑rapamycin說明自噬的產(chǎn)生減輕了游離膽固醇造成的平滑肌細胞損傷。進一步的實驗還發(fā)現(xiàn)自噬通過清除損傷的細胞器如線粒體來實現(xiàn)對游離膽固醇造成的平滑肌損傷的保護作用，但同時過量的自噬也有可能直接導致平滑肌細胞出現(xiàn)自噬樣壞死。
　　 細胞內(nèi)過量的游離膽固醇對線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器的功能結(jié)構(gòu)造成損傷。輕度損傷的細胞器可以通過激活自噬的發(fā)生得

9、以清除，從而減輕細胞器損傷帶來的細胞壓力。過量的細胞器損傷則可以激活細胞內(nèi)凋亡信號通路，造成平滑肌細胞的死亡。同時細胞內(nèi)過量的自噬也可能直接造成平滑肌出現(xiàn)自噬樣死亡。因此，游離膽固醇造成的平滑肌細胞損傷是一個由細胞凋亡，自噬和細胞壞死等多種機制調(diào)控的復雜細胞死亡事件。
　　 本論文的創(chuàng)新點主要有以下幾點：
　　 1.利用水溶性膽固醇和ACAT酶的抑制劑和平滑肌細胞共孵育來建立泡沫化和游離膽固醇過載的平滑肌細胞模型在國內(nèi)研

10、究中還較少見，很好的解決了平滑肌來源的泡沫化細胞模型穩(wěn)定性、重復性差的問題。兩類細胞模型分別模擬了動脈粥樣硬化發(fā)病過程中平滑肌細胞可能出現(xiàn)的病理變化，實現(xiàn)了體外建立起平滑肌細胞泡沫化病變的病理模型。
　　 2.本研究從線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的動力學變化著手，結(jié)合線粒體凋亡通路上多個作用靶點的深入研究，提出線粒體是游離膽固醇造成的平滑肌損傷的重要作用靶點。同時通過對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)功能的研究也驗證了游離膽固醇可以直接作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上并和線粒體通路

11、一樣對平滑肌細胞的功能狀態(tài)有著直接的影響，并且這兩條信號通路相互之間是協(xié)同作用的。通過多條細胞內(nèi)信號通路的研究比較完整的解釋游離膽固醇造成平滑肌細胞損傷的細胞機制。
　　 3.本研究利用多種技術(shù)手段驗證了自噬在游離膽固醇過載的平滑肌細胞中的激活。結(jié)合自噬特異性的抑制劑和激動劑等方法，對自噬在游離膽固醇造成的平滑肌損傷過程中可能的細胞機制做出了解釋，通過實驗驗證了自噬在游離膽固醇造成的平滑肌細胞損傷過程中起到了一定的保護作用，并且