檸條錦雞兒苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因的克隆、RNAi載體構建和相關功能分析.pdf

1、本論文以檸條錦雞兒為實驗材料，以木質素合成關鍵酶PAL為對象，進行了酶的純化、酶活性的時空差異、編碼基因的時空表達、編碼基因片段的克隆、RNAi載體構建及RNAi序列對靶酶的調控效應等方面的研究工作。 實驗結果表明：檸條干種子中存在微弱的PAL活性，當種子開始萌動后PAL活性迅速增加，活性比干種子增加近4倍，比活增加5倍多。從萌芽期到硬化期，在實驗樣品的根、莖、葉及相應器官中PAL活性和比活均呈現出?。螅〉念悞佄锞€變化。葉器

2、官中PAL活性從子葉期到速生期迅速增加，真葉期比子葉期增加2.2倍，速生期達到最大，比真葉期增加1.33倍。而硬化期活性降低，硬化期比速生期活性降低21％；莖中PAL活性從子葉期到速生期迅速增加，真葉期比子葉期增加1.48倍，速生期達到最大，比真葉期增加1.25倍。硬化期時活性大大降低，僅為速生期活性的48％；而根中PAL活性在真葉期達到最大，真葉期后活性降低，速生期、硬化期的活性分別為真葉期活性的49％和17％。各器官中PAL比活變化

3、與活性變化基本相似。 速生期葉片中的PAL，經DEAE52離子交換層析分離，可以得到2個活性峰，分別在鹽離子濃度約為0.4M和0.75M時出現。速生期莖中和真葉期根中的PAL，經DE52離子交換層析分離，均得到1個活性峰，在鹽離子濃度約為0.4M時出現。分子篩層析表明：DEAE52中分離到的活性峰均為單一活性峰組分，0.4M鹽離子洗脫峰分子量約為222KD；0.75M鹽離子洗脫峰分子量約為306KD。SDS-PAGE結果表明：分

4、子量為222KD的PAL全酶是由單一亞基組成的多聚體，亞基分子量為74KD；分子量為306KD的PAL全酶是由2種亞基組成的多聚體，亞基分子量分別為74KD和82KD。 以18SrRNA片段為內標探針，進行的半定量Northern雜交表明：檸條的不同器官和不同發(fā)育階段，pal有不同的表達量。檸條存在2類pal編碼基因，堿基數較少的b基因存在于所有樣本中，而堿基數較多的a基因僅存在于葉片中。根部器官中palb基因的表達以子葉期為最

5、高，分別約為真葉期、速生期和硬化期的1.24、1.94和5.17倍。莖中該基因以真葉期為最高，分別約為子葉期、速生期和硬化期的2.85、4.61和5.11倍。葉中該基因以真葉期為最高，分別約為子葉期、速生期和硬化期的2.69、3.56和4.48倍。僅存在于檸條葉中的pala基因表達量變化趨勢與b基因相似，以真葉期為最高，分別是子葉期、速生期和硬化期的2.82、1.93和2.38倍；但(1)a基因表達量差異比器官中b基因間的差異小；(2)

6、a基因的表達量比同期b基因的表達量低，a基因的表達量與同期pal總表達量的比值隨發(fā)育而升高。 對用TRIZOL法提取的真葉期、速生期、硬化期莖的RNA，進行了質量分析，結果表明：所提RNA樣品中OD260/OD280均超過1.9；在電泳條帶上28S/18S均超過2。 根據以DNA為模板擴增出的pal序列設計一對特異引物，以pal表達量最高的真葉期莖RNA為模板，利用RT-PCR進行擴增。擴增片段回收后連接到pGEM-T-

7、Easy載體中，對T載體中插入的pal片段測序，對序列進行讀碼分析，登陸NCBI進行同源性比對，用DNAMAN軟件與DNA為模板得出的序列進行相似性分析。測序結果表明，RT-PCR擴增出的pal片段大小為564bp，可連續(xù)編碼188個氨基酸。同源性分析表明：該序列與同區(qū)段的Trifoliumsubterran、M.Sative、Manihotesculenta和Phaseolusvulgaris的同源性分別為90.78％、92.9％、8

8、5.11％和89.72％。該基因片段與DNA為模板擴增出的片段相比，在5個位點存在堿基差異。 以pal片段為模板，2對帶不同酶切位點的pal序列為特異引物進行PCR擴增，以pBluescript為原始載體，經多次亞克隆操作，將來自pHellsgate8的intron和2個擴增的pal片段插入pCAMBIA2300中，插入方式為2個pal擴增片段反向插入到intron兩側。構建成pal相關的RNAi載體palRNAiq。

9、以農桿菌LBA4404為受體菌，將palRNAiq轉化農桿菌，采用葉盤法，將農桿菌載體轉化到模式植物煙草中。通過卡那對轉基因煙草進行初篩，對初篩的轉基因煙草，以intron兩側帶不同酶切位點的pal3’序列為一對引物，進行PCR擴增，檢測轉基因植株。以帶地高辛標記的intron序列為探針，進行轉基因植株的PCR-Southern雜交、以帶地高辛標記的CaMV35S啟動子序列為探針，通過對轉基因植株的基因組DNA和單酶切基因組DNA的So

10、uthern雜交進行轉基因株驗證。結果表明：任取10個陽性株進行外源基因驗證時，有3株為假陽性。單酶切基因組DNA的Southern雜交結果還表明在檢測出的7株轉palRNAi載體的煙草中，外源基因已整合到轉基因煙草的染色體DNA中，但不同轉基因植株中外源基因有不同插入位點和不同的拷貝數。 以帶地高辛標記的pal序列為探針，以18SrRNA為內標，進行轉基因煙草的Northern雜交實驗，結果發(fā)現：在轉palRNAi載體的轉基因