多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌主要β-內(nèi)酰胺酶基因型及同源性研究.pdf

1、鮑曼不動(dòng)桿菌是目前引起醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌。隨著廣譜抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌比例不斷上升，并在全球多處的重癥監(jiān)護(hù)病房發(fā)生爆發(fā)流行，成為抗感染治療的棘手問題。根據(jù)美國院內(nèi)感染監(jiān)測數(shù)據(jù)(NNIS)以及中國院內(nèi)感染病原菌調(diào)查顯示，不動(dòng)桿菌屬在醫(yī)院內(nèi)感染中占第4位，成為僅次于銅綠假單胞菌的又一個(gè)重要的非發(fā)酵病原菌。自1991年美國首例碳青霉烯類耐藥的不動(dòng)桿菌屬(CRA)報(bào)道以來，世界各地陸續(xù)出現(xiàn)此類菌株。近兩年來，CRA已成

2、為國際社會(huì)討論的熱點(diǎn)話題之一。因?yàn)橐坏﹣啺放嗄夏退?，就意味著?duì)現(xiàn)有的常用廣譜抗菌藥物均耐藥，即泛耐藥株(PDRA)。由PDRA引起的感染，常常無藥可用，病死率高。 不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制復(fù)雜，包括產(chǎn)生滅活酶，使抗菌藥物失活；改變作用靶部位，從而逃避抗菌藥物的作用；改變外膜孔蛋白結(jié)構(gòu)和數(shù)量，降低了細(xì)菌外膜藥物的通透性；激活外排泵系統(tǒng)，進(jìn)一步降低了細(xì)菌胞內(nèi)抗菌藥物的濃度等。近年來山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院不動(dòng)桿菌尤其是鮑曼不動(dòng)桿菌的分離率不斷

3、增加，耐藥率也不斷上升，本研究篩選2007年7月到2008年5月臨床分離的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，并對(duì)其耐藥性、同源性及主要β—內(nèi)酰胺酶基因型進(jìn)行研究。 1、多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的篩選及耐藥性研究 菌株來源：連續(xù)收集山西醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院2007年7月到2008年5月臨床分離的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌菌株。 方法：采用K—B紙片法，以大腸埃希菌ATCC25922、鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC19606為質(zhì)控菌，篩選多重耐藥不

4、動(dòng)桿菌。采用瓊脂稀釋法測定12種抗菌藥物的MIC值。抗菌藥物結(jié)果按2007年CLSI標(biāo)準(zhǔn)判定。 結(jié)果：篩選出60株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，它們對(duì)12種抗菌藥物的抗菌活性中，亞胺培南、美羅培南的耐藥率分別為45.2％、33.9％，含酶抑制劑的復(fù)合制劑頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率分別為33.3％、59.0％，米諾環(huán)素和多粘菌素E分別為16.1％、9.7％，其它抗菌藥物的耐藥率均在70％以上。 2、多重耐藥鮑曼不

5、動(dòng)桿菌同源性研究 菌株來源：連續(xù)收集山西醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院2007年7月到2008年5月臨床分離的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌菌株。 方法：利用脈沖場凝膠電泳(PFGE)技術(shù)對(duì)我院多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行同源性研究，并對(duì)其流行情況、克隆分型進(jìn)行了分析。 結(jié)果：60株菌株可分為5個(gè)克隆株，其中A、B為主要克隆株。A克隆有3個(gè)亞型共28株， B克隆有1個(gè)亞型共9株， C克隆有2個(gè)亞型共4株， D、E各有3和2株，另外還有1

6、4株散發(fā)菌株?？寺≈暝诓》績?nèi)、病房間傳播成為我院鮑曼不動(dòng)桿菌分離率上升，菌株不斷增加的主要原因。 3、多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌主要β—內(nèi)酰胺酶基因型研究 菌株來源：連續(xù)收集山西醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院2007年7月到2008年5月臨床分離的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌60株。 方法：利用三維實(shí)驗(yàn)、雙紙片協(xié)同實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行各種β—內(nèi)酰胺酶檢測。 利用PCR擴(kuò)增、序列分析明確β—內(nèi)酰胺酶基因型，PCR擴(kuò)增主要β—內(nèi)酰胺酶編碼基因

7、包括：①ESBLs基因：TEM型、SHV型、PER型、CTX—M-1型、CTX—M-9型、GES型、VEB型；②染色體攜帶的AmpC酶基因：ADC；③碳青霉烯酶基因：OXA-23型、OXA-24型、OXA-58型、IMP型、VIM型、SIM-1。 接合實(shí)驗(yàn)、質(zhì)粒抽提、電轉(zhuǎn)化等明確β—內(nèi)酰胺酶基因定位。 結(jié)果：三維實(shí)驗(yàn)陽性，提示菌株可能產(chǎn)β—內(nèi)酰胺酶。 60株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌PCR擴(kuò)增后，blaTEM基因陽性的

8、有42株，blaPER有20株陽性，2株菌株攜帶SHV-2基因；1株菌株CTX—M-1組引物擴(kuò)增得到陽性產(chǎn)物，序列分析證實(shí)為blaCTX—M-3；blaADC1-7基因陽性的有57株，blaADC8基因陽性的有2株；blaOXA-23基因陽性的有15株。 對(duì)產(chǎn)CTX—M-3型ESBLs的菌株成功進(jìn)行接合試驗(yàn)，并對(duì)其原始菌和接合菌抽提了質(zhì)粒，國內(nèi)未見相關(guān)報(bào)道。產(chǎn)SHV型的兩株菌株雖然成功抽提了質(zhì)粒，但接合實(shí)驗(yàn)雖進(jìn)行多次仍未成功，轉(zhuǎn)

9、化實(shí)驗(yàn)也未成功。其它菌株反復(fù)多次接合試驗(yàn)、抽提質(zhì)粒以及電轉(zhuǎn)化均未成功。 以上研究表明： 1、我院鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，對(duì)多粘菌素E的耐藥率最低，對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率相對(duì)較低。 2、我院多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌的分離率較高，達(dá)34％；菌株可分為5個(gè)克隆株，其中A、B為主要克隆株。提示我院有多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌小型爆發(fā)流行的可能，因此，控制院內(nèi)感染至關(guān)重要。 3、表型檢測顯示所有菌株金屬酶檢測試驗(yàn)

10、陰性；頭孢曲松、頭孢西丁三維實(shí)驗(yàn)提示菌株產(chǎn)β—內(nèi)酰胺酶。 4、我院多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌主要的ESBL基因型是blaTEM和blaPER，同時(shí)檢測到SHV型基因；碳青霉烯酶基因型為blaOXA-23，全部為CARB，提示我院的β—內(nèi)酰胺酶的基因型分布與國內(nèi)其他地區(qū)的分布情況存在很大差異。 5、我院多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌同產(chǎn)多種β—內(nèi)酰胺酶基因型的菌株較多，提示臨床治療應(yīng)針對(duì)這種耐藥分布合理選用抗菌藥物。 6、對(duì)產(chǎn)C