流體剪切力及cofilin磷酸化對成骨細胞細胞骨架改建的研究.pdf

1、骨改建的過程中機械應力起著重要的作用。在骨組織細胞感受的諸多力學信號中，流體剪切力是最主要的一種形式。在骨改建過程中，成骨細胞起著重要的作用。研究表明，流體剪切力刺激后，成骨細胞的肌動蛋白細胞骨架會發(fā)生改建。 肌動蛋白細胞骨架是一種位于細胞核及胞漿內的纖維狀蛋白質基質，是細胞內傳遞應力信號的重要途徑。應力刺激可以引起肌動蛋白細胞骨架組成的張力絲的再分布，從而引起肌動蛋白細胞骨架的改建和細胞形態(tài)的改變。但是剪切力刺激成骨細胞后，肌

2、動蛋白細胞骨架改建的微觀機制目前尚不明了。 研究表明，cofilin(絲切蛋白)是存在于真核細胞胞漿內的一種可以解聚肌動蛋白纖維的蛋白。在肌動蛋白細胞骨架的動態(tài)改建過程中，cofilin起著重要的作用。體外研究表明，多種刺激可以通過cofilin的磷酸化變化，從而調控成骨細胞的肌動蛋白細胞骨架改建。另有研究表明，cofilin介導了流體剪切力刺激引起平滑肌細胞以及成纖維細胞的肌動蛋白細胞骨架改建。而對于成骨細胞，cofilin是

3、否同樣介導了剪切力刺激引起的肌動蛋白細胞骨架改建，目前尚沒有文獻報道。 本實驗對成骨細胞施加流體剪切力作用，觀察肌動蛋白細胞骨架的改建，并通過Western blot技術檢測cofilin的磷酸化水平變化，進一步了解剪切力刺激引起的成骨細胞肌動蛋白細胞骨架改建的微觀機制。本實驗分為兩部分： 實驗一：不同時間剪切力作用對成骨細胞肌動蛋白細胞骨架改建的影響 目的：研究成骨細胞受到不同時間流體剪切力作用后，肌動蛋白細胞

4、骨架的改建變化，為下一步研究肌動蛋白細胞骨架改建的微觀機制提供實驗基礎。 方法：原代培養(yǎng)小鼠成骨細胞，堿性磷酸酶以及Von Kossa礦化結節(jié)染色對成骨細胞進行鑒定；選用μ-slide作為剪切力加載裝置，采用12 dyne/cm<'2>流體剪切力對成骨細胞作用不同時間后，用FITC-phalloidin對各實驗組細胞的F-actin染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察各實驗組肌動蛋白細胞骨架的改建變化。 結果：酶消化法與組織塊法

5、體外培養(yǎng)獲取了原代成骨細胞，堿性磷酸酶以及VonKossa礦化結節(jié)染色陽性；剪切力作用后各實驗組細胞的F-actin明顯較對照組增粗，隨時間延長，實驗組細胞的F-actin的染色逐漸增強、纖維增粗；45 min后隨剪切力作用時間的延長，肌動蛋白細胞骨架的改建趨于緩慢。 結論：采用兩種酶分段消化法，獲得了活力較旺盛、純度較高的成骨細胞；12dyne/cm2剪切力作用下，15 min便可以使成骨細胞的肌動蛋白細胞骨架發(fā)生改建。45

6、min后隨剪切力作用時間的延長，肌動蛋白細胞骨架的改建趨于緩慢。 實驗二：cofilin在介導剪切力引起成骨細胞肌動蛋白細胞骨架改建中的作用研究 目的：研究cofilin在流體剪切力引起的肌動蛋白細胞骨架改建中的作用。 方法：設計制作平行平板流室加載裝置，在此基礎上，采用12 dyne/cm<'2>的剪切力作用成骨細胞后，Western blot技術測定細胞內cofilin以及磷酸化eofilin(phospho