組織工程皮膚種子細胞培養(yǎng)及免疫原性的初步研究.pdf

1、目的：本試驗旨在探索一種能夠明顯縮短角質(zhì)形成細胞(keratinocyte，KC)培養(yǎng)時間的細胞接種密度和適合組織工程應(yīng)用的角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)基。通過檢測各代角質(zhì)形成細胞中朗格漢斯細胞(1angerhanscell，LC)、黑色素細胞(melanocyte，MC)數(shù)量變化，及異體淋巴細胞混合試驗，揭示不同代角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞免疫原性的變化，為皮膚組織工程科學選擇種子細胞提供實驗依據(jù)。 方法：(1)0.25％分離酶，0.125

2、％胰酶0.01％EDTA兩步酶法分離包皮角質(zhì)形成細胞，按不同密度接種，K-SFM、FAD培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，觀察原代融合生長時間，傳代生長情況。 (2)ATP酶化學染色，免疫組化檢測各代角質(zhì)形成細胞中朗格漢斯細胞、黑色素細胞數(shù)量的變化。 (3)將凍存的不同代數(shù)人角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞，分別與健康的同種異體志愿者的外周血淋巴細胞混合，建立異體細胞體外免疫排斥模型。通過H3-TdR標記，液體閃爍計數(shù)儀檢測異體淋巴細

3、胞增殖情況。 結(jié)果：(1)采用中性蛋白酶和胰蛋白酶聯(lián)合消化的方法，真、表皮容易分離，臺盼蘭染色，活細胞數(shù)占總細胞數(shù)的95％以上。原代角質(zhì)形成細胞接種密度在1×105/cm2～5×105/cm2時，細胞貼壁好，增殖速度快，體外培養(yǎng)周期顯著縮短。與FAD培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基比較，K-SFM培養(yǎng)的細胞呈單層生長，數(shù)代后細胞形態(tài)與原代細胞仍然十分相似，且生長較快。 (2)ATP酶染色僅在表皮鋪片中呈陽性。免疫組化染色原代角質(zhì)形成細

4、胞中混有5.8％朗格漢斯細胞和8.1％黑色素細胞，Ⅰ代角質(zhì)形成細胞中混有2.1％朗格漢斯細胞和2.8％黑色素細胞。從Ⅱ代開始，角質(zhì)形成細胞混雜的朗格漢斯細胞和黑色素細胞均消失。 (3)異體淋巴細胞增殖實驗中，cpm值隨角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞代數(shù)增高，逐漸降低。原代、Ⅰ代角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞cpm值下降明顯，Ⅱ代、ⅡⅢ代、Ⅳ代、Ⅴ代cpm值下降程度減弱，尤以成纖維細胞明顯。 結(jié)論：(1)本研究摸索出來一套適合組織工程